Calycosin通过靶向CYP1B1-AKT/SP1-GPX4轴调控结直肠癌铁死亡的分子机制
摘要
毛蕊异黄酮（Calycosin）是一种从中药中提取的天然黄酮类小分子化合物，在癌症治疗领域展现出显著的药理活性。本研究通过整合体内外实验，系统阐明了Calycosin在结直肠癌（CRC）治疗中的分子机制。
1 引言
结直肠癌（CRC）作为全球第三大常见恶性肿瘤，年新增病例超过190万，5年总体生存率仅约57%。传统化疗药物如5-FU/LV（贫血发生率15%–30%）和奥沙利铂（外周神经毒性发生率≥50%）常伴随严重毒副作用，严重影响患者生活质量。虽然免疫检查点抑制剂（PD-1/PD-L1抑制剂）在dMMR/MSI-H型CRC中显示出突破性疗效（客观缓解率ORR达40%），但约85%的pMMR/MSS患者仍存在原发性耐药。中药来源的小分子化合物因其多靶点干预策略和固有的低毒性特征，在抗癌药物研发中展现出独特优势。本研究聚焦三种代表性中药小分子：（+）-没食子儿茶素、毛蕊异黄酮（Calycosin）和地榆苷I（Ziyuglycoside I），旨在阐明其抗CRC机制。
2 材料与方法
2.1 主要化学品与试剂
（+）-没食子儿茶素（HY-N0521A）、地榆苷I（HY-N0331）和Calycosin（HY-N0519）由MCE公司合成。体内实验剂量为5 mg/kg，体外细胞实验中Calycosin工作浓度为100 μM。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（HY-100579）浓度为10 μM，AKT激酶抑制剂MK-2206 2HCl（S1078）在HT29和SW620细胞中的实验浓度分别为66和200 μM。
2.2 细胞系
人结直肠癌细胞HT29（CL-0118）、HCT116（TCHu 99）、SW620（TCHu101）和HEK-293（CL-0001）购自Pricella公司或中科院细胞库。细胞在含10% FBS和100 U/mL青霉素/链霉素（P/S）的DMEM或MEM培养基中，于37°C、5% CO2恒温恒湿环境培养。
2.3 结直肠癌皮下动物模型构建
110只SPF级BALB/c-nu小鼠（6–8周龄；18–20 g）购自河南斯博赛奥生物技术有限公司。小鼠饲养于上海市第七人民医院实验动物中心。建立HT29、HCT116和SW620细胞皮下移植瘤模型，分别用（+）-没食子儿茶素、Calycosin和地榆苷I（5 mg/kg）腹腔注射治疗。此外，构建了CYP1B1稳定敲低的HT29（sh_CYP1B1_HT29）和SW620（sh_CYP1B1_SW620）细胞系及其对照（sh_NC），用于体内研究CYP1B1敲低及Calycosin处理对肿瘤生长的影响。动物实验经上海市第七人民医院医学伦理委员会批准（伦理批准号：2025-AR-002）。
2.4 划痕实验与Transwell实验
细胞接种于6孔板，细胞融合度超过90%时用10 μL移液器吸头划痕，于0和24 h观察划痕宽度并计算细胞迁移率。Transwell实验检测细胞侵袭（铺Matrigel）和迁移（不铺Matrigel），细胞固定染色后计数。
2.5 流式细胞术检测细胞凋亡
使用Annexin V/PI试剂盒（Key GEN, KGA107）对处理后的细胞进行染色，流式细胞仪检测，Flowjo.V10软件分析数据。
2.6 转录组测序与分析
使用TRIzol试剂（Thermo Fisher, 15596018）提取细胞总RNA，质检合格后构建文库，使用illumina Novaseq 6000进行PE150测序。差异表达基因分析、GO和KEGG通路富集分析在线平台OmicStudio完成。
2.7 免疫组织化学
石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复后，用5%正常山羊血清封闭，一抗GPX4（ABclonal, A11243, 1:1000）和ACSL4（ABclonal, A20414, 1:1000）孵育，HRP标记二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水封片后光学显微镜观察。
2.8 免疫荧光
石蜡切片处理同前，抗原修复后BSA封闭，一抗GPX4（1:500）、ACSL4（1:1000）和CYP1B1（ABclonal, A1377, 1:200）4°C过夜孵育，Cy3标记二抗避光孵育，DAPI染核，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜（Leica DMI3000 B）观察，ImageJ软件定量分析荧光强度。
2.9 蛋白质印迹（WB）
RIPA裂解液（Beyotime, P0013C）提取总蛋白，SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜（Millipore, IPVH00010），5%脱脂牛奶封闭后，一抗4°C过夜孵育，相应HRP标记二抗室温孵育1 h，ECL发光液（Millipore, WBKLS0100）显影，成像系统采集图像，ImageJ软件分析。
2.10 CYP1B1敲低和过表达人结直肠癌细胞系构建
overexpression和干扰慢病毒购自汉恒生物，滴度1×109TU/mL。根据CYP1B1（NM_000104.4）序列设计OE_CYP1B1和sh_CYP1B1序列，病毒感染细胞后嘌呤霉素筛选至90%细胞表达绿色荧光，用于后续实验。
2.11 潜在药物结合靶点预测
从PubChem数据库下载Calycosin（CID: 5280448）的二维和三维结构，导入SwissTarget Prediction数据库，设定物种为“Homo sapiens”，预测潜在结合靶点，以Probability > 0.5为筛选标准。
2.12 细胞热位移分析（CETSA）
HT29和SW620细胞经DMSO和Calycosin处理24 h。为鉴定结合位点，将构建的H_CYP1B1质粒（包括野生型WT、突变体MT1和MT2）转染HEK-293细胞，再经DMSO和Calycosin处理24 h。细胞悬液分装至PCR管，在PCR仪上设置8个温度点（35°C–70°C）加热3 min，室温静置3 min，液氮冻融3循环，离心取上清，加Loading buffer煮沸10 min，进行WB实验。
2.13 分子对接与氨基酸突变位点设计
从UniProt数据库获取CYP1B1（HUMAN_Q16678）蛋白ID，从RCSB数据库下载CYP1B1（PDB_6IQ5）蛋白结构。使用AutoDock（1.5.7）软件进行Calycosin与CYP1B1蛋白的分子对接，PYMOL（2.5）可视化分析相互作用、结合能和结合位点。基于对接结果，确定Calycosin与CYP1B1蛋白的关键潜在结合位点为ASN(N)-265和Gly(G)-329。根据氨基酸位点突变原则，ASN(N)-265的最佳突变为Thr(T)-265，Gly(G)-329的最佳突变为Ala(A)-329。
2.14 野生型和突变型H_CYP1B1过表达质粒构建
基于最佳突变位点，构建野生型H_CYP1B1、H_CYP1B1 (N265T)和H_CYP1B1 (G329A)质粒。以PCDNA3.1-MCS-EF1-ZsGreen（Genomeditech, GM-8630P1）为载体质粒，E. colistbl3菌株（ThermoFisher, G1036）进行转化。
2.15 启动子转染与荧光素酶报告基因检测
利用Human TFDB数据库预测SP1在GPX4启动子-2000至200 bp片段内的三个结合位点。将GPX4启动子区片段（Full, Mut1, Mut2, Mut3）克隆至pGL3-basic载体，SP1克隆至pcDNA3.1–3xflag载体（Hanbio）。HEK-293T细胞共转染pGL3-Basic-h-GPX4（Full, Mut1, Mut2, Mut3）或pGL3-Basic（NC）与pcDNA3.1–3xflag-h-SP1或pcDNA3.1–3xflag及pRL-TK海肾荧光素酶载体。48 h后提取细胞裂解液，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（HB-DLR-100, Hanbio）检测荧光素酶活性，多功能酶标仪（SuPerMax3100）检测发光信号。
2.16 统计分析
使用GraphPad Prism v8.0进行统计分析。数据以均值±标准误（Mean ± SEM）表示。p值和显著性采用双尾t检验、单因素方差分析（One-Way ANOVA）和双因素方差分析（Two-Way ANOVA）确定。
3 结果
3.1 Calycosin有效抑制结直肠癌小鼠皮下肿瘤生长
为筛选治疗CRC有效的小分子药物，构建了人CRC（HT29、HCT116、SW620）皮下移植瘤小鼠模型，考察三种中药小分子化合物（+）-没食子儿茶素、Calycosin和地榆苷I的治疗效果。结果显示，在相同剂量（5 mg/kg）腹腔注射给药下，三种化合物均表现出治疗功能，但疗效程度不同。在HT29、HCT116和SW620模型中，Calycosin均显示出最显著的肿瘤生长抑制作用。毒性评价表明，5 mg/kg剂量的三种化合物对BALB/c-nu小鼠安全。
3.2 Calycosin体外抑制结直肠癌细胞迁移、EMT并促进凋亡
Calycosin对HT29、HCT116和SW620细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为124.6、132.7和113.8 μM。用100 μM Calycosin处理人CRC细胞24 h，划痕实验表明Calycosin有效抑制细胞迁移，Transwell实验证实其抑制细胞迁移和侵袭。Calycosin处理增强E-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达，抑制N-钙黏蛋白（N-Cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达，表明其抑制EMT。流式细胞术检测显示Calycosin诱导人CRC细胞凋亡，其中SW620细胞最敏感。
3.3 Calycosin激活结直肠癌细胞中铁死亡相关蛋白的表达
用DMSO和Calycosin（100 μM）处理SW620细胞24 h后进行全基因组转录组测序。与DMSO相比，Calycosin组有296个基因上调和322个基因下调（|Log2FC| > 0.5, p< 0.05）。GSEA分析显示，铁死亡相关基因变化最显著，促铁死亡蛋白ACSL1、ACSL4、NOX1基因上调，抗铁死亡蛋白GPX4、FTH1基因下调。GO和KEGG通路富集分析显示这些基因主要富集于铁死亡相关信号通路。WB验证表明，Calycosin处理下调GPX4和FTH1，上调NOX1和ACSL4蛋白表达。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1处理可逆转Calycosin引起的蛋白表达变化并显著抑制Calycosin诱导的凋亡，提示Calycosin可能通过调控铁死亡影响肿瘤细胞功能。体内实验显示，Calycosin治疗组小鼠肿瘤组织中GPX4下调、ACSL4上调。
3.4 Calycosin与CYP1B1的Gly-329位点结合
通过SwissTarget Prediction数据库预测Calycosin潜在结合靶点，CYP1B1和IL2结合概率最高。GEPIA数据库分析显示仅CYP1B1与CRC患者总体生存（OS）预后呈显著负相关。HPA数据库表明CYP1B1在CRC患者中高表达。选择CYP1B1表达最高的HT29和SW620细胞，CETSA检测显示Calycosin处理24 h后，CYP1B1蛋白可抵抗温度诱导的降解，表明Calycosin能与CYP1B1结合并维持其热稳定性。分子对接显示Calycosin与CYP1B1具有高结合亲和力（Affinity = -9.7），并鉴定ASN(N)-265和Gly(G)-329为潜在结合位点。点突变实验证实，Gly-329是Calycosin与CYP1B1结合的关键位点。
3.5 CYP1B1敲低和过表达分别抑制和促进结直肠癌细胞功能
构建稳定敲低CYP1B1的SW620和HT29细胞系（sh_CYP1B1）。与NC组相比，sh_CYP1B1组细胞迁移和侵袭能力受抑制，细胞死亡增加。CYP1B1敲低下调GPX4、上调ACSL4蛋白表达。构建CYP1B1过表达（OE_CYP1B1）细胞系，结果显示OE_CYP1B1增强细胞迁移和侵袭能力，但对细胞死亡无显著影响，并促进GPX4、抑制ACSL4蛋白表达。Calycosin处理同样抑制OE_CYP1B1细胞的迁移和侵袭。
3.6 CYP1B1和Calycosin在小鼠模型中对结直肠癌功能的影响及相互作用分析
使用稳定敲低CYP1B1的HT29和SW620细胞建立皮下移植瘤模型，并在sh_CYP1B1组小鼠中给予Calycosin治疗。与NC组相比，敲低CYP1B1有效抑制体内SW620和HT29细胞生长。sh_CYP1B1组与sh_CYP1B1 + Calycosin组在肿瘤大小、重量以及GPX4和ACSL4表达上无显著差异，提示敲低CYP1B1后，Calycosin可能失去了调控靶点。
3.7 CYP1B1通过激活AKT/SP-1信号通路促进GPX4表达
利用SW620细胞转录组数据，分析调控GPX4的关键转录因子（Nrf2、SP1、ELK1、TFAP2A、SP2、CREM），发现Calycosin抑制SP1和TFAP2A表达。CYP1B1敲低和Calycosin处理均抑制核内p-SP1和TFAP2A表达，对p-SP1抑制更强。分析调控SP1的关键激酶，发现Calycosin抑制AKT1、MAPK1（ERK2）和MAPK3（ERK1）表达。CYP1B1敲低和Calycosin处理抑制AKT1和ERK1/2磷酸化水平，进而抑制核内p-SP1表达，其中磷酸化AKT抑制效率更高。AKT抑制剂MK-2206处理显著降低p-SP1和GPX4表达水平。荧光素酶报告基因实验证实，SP1通过结合GPX4启动子上的Mut1（-1862 ~ -1854）和Mut3（-125 ~ -117）位点激活其转录。
4 讨论
本研究通过整合体内外实验，系统阐明了Calycosin治疗CRC的分子机制。Calycosin通过靶向CYP1B1，抑制AKT活化，减少SP1与GPX4启动子的结合，下调GPX4、上调ACSL4，诱导铁死亡，从而抑制肿瘤进展和转移。该研究不仅解释了Calycosin的抗肿瘤活性，也为CRC治疗提供了新的分子靶点。考虑到CYP1B1抑制剂已可临床联合PARP抑制剂治疗卵巢癌，且CYP1B1是Calycosin的靶点，未来应评估Calycosin与相关化疗或靶向药物联用治疗CRC的疗效，为其临床转化应用奠定基础。
5 结论
本研究阐明天然黄酮化合物Calycosin通过靶向CYP1B1诱导铁死亡抑制CRC。其机制涉及结合CYP1B1、抑制AKT活化、减少SP1与GPX4启动子结合，从而调控铁死亡关键蛋白表达，抑制肿瘤恶性行为。这些发现为CRC靶向治疗提供了新的分子基础。
作者贡献
别丽晗：实验设计、数据管理、形式分析、方法学、初稿撰写。雷欣和吴迪：数据管理、形式分析、方法学、初稿撰写。张阳、何成山、刘璐瑶、周佳伟：方法学、信息收集、论文修改和定稿。周鑫、卢莹莹、徐政：调查研究、监督、审阅和编辑。所有作者阅读并批准最终稿件。
资助
本研究得到上海市浦东新区卫生健康委员会科研项目（PW2022A-22）支持。
伦理声明
动物实验经上海市第七人民医院医学伦理委员会批准（伦理批准号：2025-AR-002）。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获取。
