Mohammad Qutub|Amol Tatode|Tanvi Premchandani|Jayshree Taksande|Milind Umekar
印度马哈拉施特拉邦纳格浦尔坎普蒂市Smt. Kishoritai Bhoyar药学院药学系
引言
体积性肌肉损失（VML）是由于创伤或手术导致的骨骼肌组织和基底膜结构的永久性丧失（图1），从而引发功能缺陷和慢性残疾[1]，[2]。在战斗相关的肢体损伤等极端情况下，VML被认为是长期肌肉相关残疾的主要原因[3]。传统的治疗方法，如支具固定或肌肉移植，通常无法完全恢复功能，而侵入性移植手术则受到供体部位并发症、炎症、组织整合不良以及神经再支配失败等限制。这些临床挑战凸显了迫切需要新的疗法，这些疗法能够在促进肌肉再生的同时减轻手术的缺点[4]，[5]。
热响应性（“热凝胶”）水凝胶作为一种有前景的组织修复支架，因为它们可以作为低粘度液体输送，并在体温下原位固化[6]，[7]。这些智能生物材料利用温度触发的凝胶化机制——例如，聚（环氧乙烷）-聚（丙氧基乙烯）-聚（环氧乙烷）（聚氧酰胺）这样的嵌段共聚物在温度从室温升至生理水平时形成凝胶[8]，[9]，[10]。实际上，这意味着可注射的配方可以在肌肉缺损处迅速固化，形成一个三维基质，模拟细胞外环境，而无需有机溶剂或外部触发因素[11]，[12]。这类水凝胶还能实现生物活性因子的局部持续释放，可能比全身给药所需的剂量更低，同时减少脱靶效应[13]，[14]。
为了增强再生效果，我们在热凝胶支架中加入了两种生物活性成分：硫酸阿格玛丁（AgS）和透明质酸（HA）。阿格玛丁是精氨酸的脱羧形式，在临床前模型中显示出良好的神经保护、抗炎和促血管生成作用。这些多方面的作用表明，阿格玛丁可以通过调节一氧化氮信号通路和氧化应激途径来支持肌肉修复。重要的是，从水凝胶中局部释放阿格玛丁可以在损伤部位实现持续、高浓度的暴露，从而以远低于全身注射所需的总量实现有效治疗[15]，[16]，[17]，[18]，[19]，[20]。透明质酸是一种天然存在的糖胺聚糖，对细胞外基质（ECM）的结构有重要贡献，促进细胞迁移、增殖和粘附[21]。其亲水性和生物相容性有助于组织水化，并支持基质形成，使其成为再生医学用水凝胶的关键成分[22]，[23]。在组织工程中，通常使用1–3%（w/v）的透明质酸浓度来平衡机械强度和注射性：低浓度可能结构不足，而高浓度则会导致凝胶化速度变慢和粘度增加[24]，[25]，[26]。在我们的配方中，我们选择了2.5%（w/v）的透明质酸，以最大化细胞粘附性能和水化效果，同时不影响热凝胶的转化。同样，我们选择了2.5%（w/v）的阿格玛丁，以确保其强大的生物活性；这一浓度与先前的研究一致，这些研究表明亚百分比的阿格玛丁可能效果不佳，而高百分比的加载则可以维持数周的药物释放。2.5%/2.5%的比例是在生物效能和水凝胶稳定性之间取得的一种平衡。我们还通过检测pH 7.4和pH 5.5下的行为来评估局部pH环境对水凝胶性能的影响。生理上，健康的肌肉组织接近中性pH（7.4），而受伤和缺血区域由于乳酸积累和炎症常常变得酸性。在pH 5.5下进行测试可以模拟严重的损伤微环境，有助于预测凝胶化动力学、膨胀和药物释放在炎症条件下的变化[27]。
在这项研究中，我们全面表征了富含阿格玛丁和透明质酸的热敏水凝胶，用于治疗体积性肌肉损失（VML）。该水凝胶基质基于类似Pluronic®的共聚物系统，在体温下发生溶胶-凝胶转变，因此可以以液体形式注射，然后固化成支撑性支架。我们评估了关键的物理化学性质，包括凝胶化时间、流变模量和在中性和酸性条件下的膨胀情况，以了解材料在不同组织状态下的行为。药物释放曲线也进行了表征，以确保其与肌肉再生时间要求相符。
这种急性给药策略的治疗原理基于骨骼肌再生的时间生物学特性。在VML损伤后，卫星细胞在28天内经历一系列协调的进程：激活和命运决定（0–48小时），此时细胞感知损伤信号并进入细胞周期；增殖（3–7天），表现为肌母细胞快速扩张；分化（7–14天），肌母细胞融合成肌管；以及成熟（14–28天），涉及纤维肥大和神经肌肉接头形成。关键的是，卫星细胞的命运决定发生在最初的24–48小时内，为后续几周的再生过程确定了方向。这一狭窄的干预窗口意味着早期的、高浓度的生物活性物质输送可以启动自我维持的细胞程序，这些程序可以自主地完成所有再生阶段，而无需持续的药物存在。这种“触发和放大”机制类似于在8–12周评估的单剂量BMP-2骨骼再生策略，其中急性干预可以产生持续的效果。因此，我们的28天评估捕捉了急性生物活性物质在关键0–48小时窗口内的累积效果，而不是持续的药理作用，因为肌肉再生是通过具有明确干预窗口的离散时间阶段进行的，而不是需要持续的药物暴露。最后，我们在啮齿动物的胫前肌VML模型中测试了这种水凝胶。体内研究在28天后评估了再生结果，测量了握力、步态参数和组织学恢复情况。这些实验验证了2.5%阿格玛丁/透明质酸水凝胶比单一成分或安慰剂对照组具有更好的功能恢复效果。所有治疗效果都是通过一次手术注射实现的，表明时间优化的急性给药可以永久性地重新导向肌肉再生过程。总体而言，通过结合已建立的再生信号（阿格玛丁和透明质酸）与专为急性损伤阶段快速释放设计的热响应性输送载体，我们的方法为开发可注射的生物活性支架提供了转化途径，这些支架能够在体积性肌肉损失后恢复结构和功能。
材料
硫酸阿格玛丁（CAS号2482-00-0）、聚氧酰胺407（CAS号9003-11-6）和聚氧酰胺188（CAS号9003-11-6）从Sigma Chemicals（美国密苏里州圣路易斯）购买。透明质酸（CAS号9004-61-9；分子量500 kDa）从Fine Chem Laboratories（印度孟买）购买。邻苯二甲醛（CAS号643-79-8）从Sigma Aldrich购买。巯基乙醇（CAS号60-24-2）从Loba Chemie（印度孟买）购买。
配方前研究
使用FTIR分析研究了水凝胶各组分之间的分子相互作用。FTIR光谱是在Bruker Alpha II ATR上记录的。样品的扫描范围为400–4000 cm−1。这种分析对于识别样品中存在的官能团以及检测药物与辅料之间可能的相互作用至关重要[28]，[29]。
温度敏感水凝胶的制备
热敏水凝胶采用冷方法制备。
FT-IR光谱
在配方成分和水凝胶的FTIR光谱中（图2I），纯硫酸阿格玛丁在3400 cm−1附近显示出宽吸收带，这归因于N–H和O–H伸缩振动的重叠；而特征性的硫酸根ν3和ν4伸缩带分别出现在1220和1050 cm−1附近。NH2在1625 cm−1处的断裂和C–N伸缩在1150 cm−1附近进一步证实了阿格玛丁的胍结构。透明质酸显示出宽的羟基特征。
结论
本研究成功开发并优化了一种基于热响应性聚氧酰胺的水凝胶系统，用于共同输送硫酸阿格玛丁（AgS）和透明质酸（HA），用于治疗体积性肌肉损失（VML）。关键的方法学改进表明，该水凝胶作为快速释放 depot，在18–24小时内完全降解，这在治疗上具有优势，因为它能在关键的急性损伤阶段释放生物活性物质。通过32因子进行系统优化...
未引用的参考文献
[63], [64], [65], [66], [67], [68], [69], [70], [71], [72], [73], [74], [75]
CRediT作者贡献声明
Mohammad Qutub：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。
Amol Tatode：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。
Tanvi Premchandani：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。
Jayshree Taksande：撰写 – 审稿与编辑。
Milind Umekar：撰写 – 审稿与编辑。
