Marsupenaeus japonicus（ kuruma虾）是一种具有重要商业价值的甲壳类物种，既可野生捕捞也可人工养殖。在中国，M. japonicus的大规模养殖已经非常成熟，预计到2024年其养殖产量将达到44,499吨[1]。M. japonicus对蛋白质的需求较高，但其蛋白质利用率相对较低[2]。这种差异导致大量的未利用氮废物以残余饲料和排泄物的形式释放到水产养殖环境中。这些含氮有机化合物的分解会释放氮，进而通过硝化作用转化为亚硝酸盐[3]。因此，这一过程成为水产养殖中亚硝酸盐来源的一个重要因素。
亚硝酸盐是水产养殖中普遍存在且具有毒性的物质，甲壳类动物对其特别敏感[4]。它是在微生物硝化过程中产生的中间产物，通常以低浓度存在[5]。然而，在集约化养殖条件下，来自残余饲料和养殖物种排泄物的含氮化合物的积累会导致水中亚硝酸盐浓度显著升高[3]。亚硝酸盐-N压力会导致亚硝酸盐在血淋巴中积累，从而抑制血蓝蛋白的生成，影响氧气运输，最终导致疾病和死亡[6]。例如，在暴露于30 mg/L亚硝酸盐48小时后，Procambarus clarkii表现出运动活性降低和肠道功能障碍[7]。Litopenaeus vannamei在急性亚硝酸盐暴露后表现出神经毒性症状，包括游泳行为迟缓[8]。
亚硝酸盐-N会促进活性氧（ROS）的过量产生，导致氧化应激、DNA损伤和细胞凋亡[9]。亚硝酸盐暴露可以激活细胞应激信号级联反应，其中Nrf2-Keap1调控通路在保护细胞免受氧化损伤和外来物质损害方面起着关键作用[10]。这种适应性反应主要由核因子红系2相关因子2（Nrf2）调控，它是抗氧化反应基因表达的主要调节因子。当亚硝酸盐引发氧化应激时，Nrf2会被激活并转移到细胞核中。进入细胞核后，Nrf2会与目标基因调控区域中的抗氧化响应元件（AREs）结合，从而触发关键抗氧化酶（如血红素加氧酶-1（HO-1）、NAD(P)H醌氧化还原酶-1（NQO1）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化氢酶（CAT）的表达增加。这种协调的基因激活增强了细胞的抗氧化防御系统[11]。在暴露于60 mg/L亚硝酸盐72小时后，P. clarkii的鳃组织表现出明显的氧化应激，表现为抗氧化酶活性升高、氧化损伤指标增加以及抗氧化相关基因表达上调[12]。研究表明，Nrf2参与Penaeus monodon对细菌感染的免疫防御，并调节GPx基因的表达[13]。Nrf2-Keap1通路在抗氧化保护中的作用已被广泛认可，但甲壳类动物在亚硝酸盐诱导的氧化应激下的具体分子反应机制尚未完全了解。这些知识空白可能是由于甲壳类动物和鱼类在抗氧化防御系统上的内在差异，这些差异源于它们不同的生理和免疫特性。甲壳类动物主要依靠血蓝蛋白进行氧气运输，其抗氧化反应与异质性的血细胞系统紧密相关[14]，而鱼类的抗氧化系统则以血红蛋白和更复杂的酶系统为中心[15]。此外，鱼类依赖专门的免疫细胞进行免疫和抗氧化反应，这与甲壳类动物的颗粒/半颗粒血细胞不同[14, 16]。因此，甲壳类动物在Nrf2-Keap1等保守通路的调节和响应上可能与脊椎动物存在差异。
先前的研究表明，ROS可以直接引发内质网（ER）应激。ROS的产生受到多种环境污染物的刺激，表明氧化应激-ER应激轴是外源因素诱导ER功能障碍的关键途径[17]。在大多数真核细胞中，未折叠蛋白反应（UPR）是一个监测ER功能并确保蛋白质稳态的信号网络。该系统调节关键的转录和翻译过程，并促进翻译后修饰，以减少错误折叠蛋白质的影响，从而恢复ER的稳态[18]。在大多数脊椎动物中，UPR包括三个主要的ER驻留传感器：肌醇需求酶1（IRE1α和β）、激活转录因子6（ATF6α和β）和蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）[19]。经典的凋亡途径由ER应激启动，其特征是BAX和BAK这两种重要的线粒体促凋亡BCL-2家族成员的构象激活，导致凋亡小体的形成以及随后的效应Caspase-3的切割和激活[15]。亚硝酸盐暴露导致P. monodon中与凋亡相关的基因（包括Caspase-3和Caspase-9）显著上调[20]。在Pacrobrachium rosenbergii中也观察到了类似的转录反应[21]。在暴露于5 mg/L亚硝酸盐48小时后，L. vannamei表现出更明显的生理变化以及与抗氧化防御、ERS、免疫反应和凋亡相关的关键基因的转录上调[22, 23]。研究表明，镉诱导的氧化细胞损伤主要通过Nrf2通路介导，而抑制Nrf2表达会加重M. japonicus鳃组织的结构破坏、氧化应激和凋亡反应[24]。
作为外源性抗氧化剂，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）通过直接清除ROS和间接促进谷胱甘肽（GSH）合成来增强细胞的抗氧化能力[25]。越来越多的证据表明，在体外研究中，使用各种实验模型证实了NAC能够预防毒素、农药和药物引起的损伤[26]。NAC的使用显示出降低与ROS产生相关的生物标志物水平、减轻肝脏损伤和增强肝脏抗氧化防御的有效性[27]。NAC能够激活Nrf2-Keap1信号通路[28]。体外研究显示，NAC有助于Nrf2转移到细胞核中，增加GPx和SOD等关键抗氧化酶的表达。这些酶有助于消除多余的ROS，从而减轻线粒体相关的损伤[29]。关于NAC通过类似的Nrf2-Keap1通路保护甲壳类动物免受亚硝酸盐伤害的程度仍存在不确定性。集约化养殖由于密度过高，会导致水中亚硝酸盐氮水平的升高，这是一个亟需解决的环境问题。在本研究中，我们探讨了抗氧化反应、ER应激和凋亡，以了解Nrf2-Keap1信号通路如何在暴露于亚硝酸盐压力的M. japonicus中调节抗氧化防御。通过系统比较PBS对照组和NAC处理组在分子和生理功能水平上的差异，本研究利用外源性抗氧化剂NAC来研究Nrf2-Keap1通路在减轻M. japonicus中亚硝酸盐诱导的氧化应激中的作用。最近的研究表明，NAC对亚硝酸盐诱导的毒性具有显著疗效，这证明了其作为干预策略的潜力。在啮齿动物模型中，预防性给予NAC显著减轻了NaNO2引起的血液毒性、肾毒性和全身氧化应激，其在血浆和细胞成分中都表现出保护作用[30]。此外，NAC的安全性和调节炎症及凋亡信号通路的能力增加了其作为治疗剂的吸引力[31]。支持其在水产养殖中的应用，研究表明，在高密度条件下饲养的L. vannamei幼体中，添加0.2%的NAC显著提高了生长性能、抗氧化能力和免疫反应[32]。然而，关于NAC通过类似的Nrf2-Keap1通路保护M. japonicus免受亚硝酸盐伤害的程度仍存在不确定性。
