1 引言
脊髓损伤（SCI）是一种破坏性的神经系统疾病，导致严重的运动、感觉和自主神经功能障碍。中枢神经系统（CNS）创伤，包括SCI，通常分为原发性和继发性损伤阶段。原发性损伤由机械力对神经组织造成的急性损伤定义，导致很大程度上不可逆的细胞损失。继发性损伤阶段的特点是创伤后延迟的破坏性炎症，随着时间的推移导致进一步的组织损伤，并为神经元再生创造不利环境。
细胞外囊泡（EVs）是膜结合的纳米颗粒，作为多种生物活性物质的载体，包括蛋白质、非编码RNA、核酸和脂质，这些物质可随刺激而变化。EVs已成为CNS中关键生理功能的介质，并在神经创伤继发性损伤阶段的进展中通过将生物活性物质转移到局部CNS内的受体细胞而发挥关键作用。除了局部通讯，新出现的证据表明，CNS创伤和神经炎症诱导EVs释放到循环中，从而强烈激活肝脏以启动肝脏急性期反应，导致促炎细胞因子和趋化因子的产生。这些物质反过来激活全身免疫系统并加速CNS损伤的进展。这些研究强调了CNS释放的EVs可以调节受体肝脏的功能。然而，反向通路，即SCI激活的肝脏来源的EVs是否以及如何通过器官间通讯影响SCI后的神经元再生，在很大程度上仍不清楚。
本研究揭示了一种由EVs介导的新型肝脏-脊髓器官间通讯，该通讯在SCI后主动抑制神经元修复。研究表明，SCI后肝脏来源的EVs通过循环迅速转运至受损脊髓，并被病变部位的内源性神经干细胞（NSCs）和星形胶质细胞优先摄取。这些EVs抑制NSCs向神经元和少突胶质细胞分化，并促进星形胶质细胞向神经炎症反应性星形胶质细胞极化。进一步的质谱（MS）蛋白质组学分析和RNA测序发现，SCI迅速诱导核糖体蛋白S3（RPS3）在肝脏来源的EVs（LEVs）中富集，并确定活化的Kupffer细胞（KCs）是RPS3的主要来源。RPS3诱导核因子κB（NF-κB）信号通路的激活，从而介导病变部位NSCs的分化和星形胶质细胞的极化。在体内清除KCs或肝脏中的RPS3可有效减弱NF-κB激活，恢复轴突再生和髓鞘再生，并促进神经功能恢复。这些发现表明，富含RPS3的LEVs在SCI后通过调节CNS再生微环境发挥关键作用。
2 结果
2.1 肝脏EVs改变局部内源性NSCs分化
为研究肝脏如何影响SCI后的病变部位，研究人员在损伤后第1天（1 dpi）收集了LEVs。这些收集的LEVs通过透射电子显微镜、动态光散射和蛋白质印迹进行鉴定，然后用PKH26荧光染料标记。随后，将PKH26标记的LEVs通过尾静脉注射到SCI大鼠体内，并对脊髓NSCs、星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞进行免疫染色。结果显示，PKH26标记的LEVs主要被NESTIN阳性的NSCs和GFAP阳性的星形胶质细胞摄取。相比之下，在TUJ1阳性的神经元和CNPase阳性的少突胶质细胞中很少发现PKH26标记的EVs，这归因于它们在病变部位的稀疏存在。
由于内源性NSCs在SCI后的自我神经发生中起关键作用，研究人员评估了LEVs对NSCs分化的生物效应。收集SCI后不同时间点的LEVs并与NSCs共培养。免疫染色显示，来自SCI大鼠的LEVs，特别是损伤后第1天和第3天（1 dpi-LEVs和3 dpi-LEVs）的LEVs，显著降低了CNPase阳性的少突胶质细胞和TUJ1阳性的神经元的百分比，表明LEVs阻止了NSCs向少突胶质细胞和神经元的分化。
2.2 损伤后LEVs、血液和病变部位中RPS3表达上调
为确定负责介导NSCs分化的LEV蛋白，研究人员收集了SCI患者血浆样本中的EVs（血浆EVs，PEVs）。蛋白质组学评估显示，与健康对照组相比，SCI患者来源的PEVs中有76种蛋白上调，26种蛋白下调。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示，最显著的富集通路是核糖体通路。基因集富集分析将43个差异表达蛋白映射到核糖体。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析确定RPS3为排名最高的蛋白。
为了进一步评估PEVs中货物的改变是否与肝脏相关，研究人员对SCI后第1天和第3天的肝脏进行了RNA测序。在1 dpi时，肝脏中有431个基因上调，将这些结果与SCI患者PEVs中的差异表达蛋白相结合，发现这431个改变基因中有9个蛋白在PEVs中上调。肝脏中改变最显著的基因是RPS3。在3 dpi时，肝脏中鉴定出120个上调基因，其中4个来自这些改变基因的蛋白在PEVs中富集，尤其是RPS3。基于这些数据，研究人员提出RPS3（小40S核糖体亚基的一个组成部分，主要与起始因子相关以促进核糖体成熟和翻译起始）可能是LEVs相关生物效应的原因。
为确认SCI是否诱导了LEVs中RPS3表达的上调，研究人员检测了SCI后LEVs中RPS3的表达。ELISA检测显示，SCI后LEVs中RPS3的富集显著增加，在1 dpi和3 dpi达到峰值。此外，用1 dpi LEVs处理NSCs 24小时后的免疫染色显示，RPS3阳性细胞的比例显著上升。这些发现表明SCI促进了RPS3在LEVs中的富集。为了进一步研究这些携带RPS3的LEVs是否直接转运到病变部位，研究人员采用尾静脉注射对肝细胞有强亲和力的腺相关病毒血清型8（AAV8），以在肝脏中靶向过表达FLAG标记的RPS3。蛋白质印迹证实了FLAG-RPS3在PEVs和LEVs中的存在。病变部位的FLAG免疫染色显示，肝脏来源的FLAG+RPS3存在于Nestin+NSCs和GFAP+星形胶质细胞中，证实了SCI后RPS3从肝脏到脊髓病变部位的直接转移。
2.3 携带RPS3的LEVs通过激活NF-κB信号通路调控NSC分化
为研究RPS3是否影响NSC分化，研究人员首先通过免疫染色检测了病变部位RPS3的表达，发现RPS3阳性细胞的比例在SCI后增加，并且在1 dpi和3 dpi时，超过30%的NESTIN阳性NSCs被RPS3标记，表明病变部位内源性NSCs中RPS3的上调。随后，研究人员用RPS3处理NSCs。由于RPS3被认为是NF-κB的一个功能亚基，它与p65亚基相互作用，显著增强NF-κB复合物与特定κB位点的DNA结合亲和力，从而激活下游基因的转录，因此检测了磷酸化P65（P-P65）及其下游基因（Il-6）的表达。免疫染色显示，RPS3处理促进了P-P65向细胞核的转运，并增加了P-P65阳性细胞的百分比，同时伴有Il-6基因表达的上调。与病变部位RPS3的表达一致，SCI后NSCs中P-P65的表达水平显著增加，在1 dpi达到峰值。为检测RPS3对NSC分化的生物效应，将NSCs与RPS3共培养，导致CNPase和TUJ1阳性细胞的百分比减少。此外，这些RPS3诱导的效应可被P65核转运抑制剂（E）-2-氟-4′-甲氧基芪（JSH23）所消除。这些数据表明RPS3通过激活NF-κB信号通路调控NSC分化。
为了进一步确认LEVs中RPS3的富集是否与NSC分化的改变效应相关，研究人员用来自假手术大鼠（sham-LEVs）或1 dpi大鼠（1 dpi-LEVs）的LEVs处理NSCs，并通过免疫染色检测P-P65的表达。与对照组相比，sham-LEVs未诱导P-P65的核转运或增加P-P65阳性细胞的百分比。相反，1 dpi-LEVs促进了P-P65的核转运并增加了P-P65阳性细胞的百分比。PCR分析显示，IL-6基因表达被1 dpi-LEVs上调，但sham-LEVs无此作用。此外，在存在1 dpi-LEVs的情况下，向NSCs加入JSH23抑制了1 dpi-LEVs诱导的对NSC分化的效应。这些发现表明肝脏来源的RPS3通过激活NF-κB信号通路调控NSC分化。
2.4 KCs驱动肝脏诱导的器官间RPS3递送
肝脏巨噬细胞对于介导肝脏免疫和维持肝脏稳态至关重要。因此，研究人员假设活化的肝脏巨噬细胞可能有助于肝脏中RPS3的上调。为证实这一假设，首先检测了RPS3在肝脏巨噬细胞中的表达。免疫染色显示，RPS3的表达在CD68+的肝脏巨噬细胞中损伤后6小时（hpi）迅速增加，并在1 dpi和3 dpi达到峰值。随后，研究人员通过静脉注射氯膦酸盐清除大鼠的肝脏巨噬细胞。与未处理的SCI大鼠相比，氯膦酸盐注射显著降低了LEVs中RPS3的表达。免疫染色显示，肝脏中巨噬细胞的清除降低了1 dpi和3 dpi时病变部位RPS3和P-P65的表达。为确定肝脏巨噬细胞来源的RPS3是否能在SCI后直接转移到病变部位，研究人员培养了原代Kupffer细胞（驻留的肝脏巨噬细胞），并用绿色荧光蛋白（GFP）标记的外源性RPS3转染它们。接着，收集来自过表达GFP-RPS3的KCs的EVs（KEVsGFP-RPS3），并进行PKH-26标记。荧光显微镜显示GFP-RPS3和PKH-26在一簇EVs中共表达。此外，为确定非EVs分泌因子是否能实现从肝脏到病变部位的器官间递送，研究人员收集了来自过表达GFP-RPS3的KCs的EV耗竭条件培养基（KCMGFP-RPS3）。在体外，用PKH26标记的KEVsGFP-RPS3或KCMGFP-RPS3处理NSCs 6小时，发现GFP与PKH26在NSCs的细胞质内共定位。相比之下，非EVs的KCMGFP-RPS3处理仅诱导细胞质内出现GFP-RPS3。随后，研究人员分别将KEVsGFP-RPS3和KCMGFP-RPS3注射到SCI大鼠体内。24小时后，在病变部位的NESTIN阳性NSCs中发现了GFP和PKH-26双阳性的KEVsGFP-RPS3。然而，在接受KCMGFP-RPS3注射的大鼠的病变部位未观察到GFP标记的RPS3。这些数据表明EV膜在肝脏-脊髓长距离器官间递送RPS3中起重要作用。
为研究KEVs是否通过NF-κB信号通路抑制NSC分化，研究人员将NSCs与KEVs共培养。由于CNS损伤强烈激活全身免疫系统，导致肝脏中促炎细胞因子上调，研究人员用25 ng/mL肿瘤坏死因子α（TNF-α）或50 ng/mL IL-6预处理KCs，然后收集KEVs。与对照组或未预处理的KEVs相比，来自TNF-α或IL-6刺激的KCs的EVs（TNF-α KEVs或IL-6 KEVs）显著增加了KCs中RPS3的表达和EVs中RPS3的富集。通过免疫染色检测P-P65表达显示，向NSCs加入TNF-α-或IL-6-KEVs显著增加了P-P65阳性细胞的百分比并促进了P-P65向细胞核的转运。为了进一步确认这些外源性RPS3是否能在NSCs中与p65相互作用，研究人员用FLAG标记的外源性RPS3转染KCs。然后，收集来自这些FLAG-RPS3转染的KCs的EVs（KEVsFLAG-RPS3）并加入NSCs。免疫染色显示FLAG阳性的RPS3定位于细胞质内，证实这些KCs来源的FLAG-RPS3被NSCs摄取。随后，使用P65抗体进行的下拉实验证明了其在KEVsFLAG-RPS3处理的NSCs中与FLAG-RPS3的相互作用。此外，对NSC分化的评估显示，TNF-α-或IL-6- KEVs处理显著降低了神经元和少突胶质细胞的百分比。加入JSH23显著抑制了这些TNF-α-或IL-6- KCs诱导的对NSC分化的生物效应，增加了神经元和少突胶质细胞的比例。这些数据表明，促炎细胞因子刺激富集了KEVs中的RPS3，后者通过激活NF-κB信号通路调控NSC分化。
有趣的是，肝脏中RPS3的免疫染色显示，在假手术组中，RPS3表达主要定位于CD68−细胞。与CD68+细胞在6 hpi时RPS3的快速富集相反，CD68−细胞中的表达水平在此时间点保持不变。然而，在1 dpi时检测到这些CD68−细胞中RPS3表达的延迟增加。此外，清除肝脏巨噬细胞显著消除了1 dpi时CD68−细胞中RPS3的上调。这些发现表明肝脏巨噬细胞可能在启动肝脏中RPS3上调中起关键作用。由于肝细胞是肝实质的主要上皮细胞，约占肝脏体积的80%和肝细胞数量的60%，研究人员接下来检测了RPS3在肝细胞中的表达。正如所料，白蛋白（ALB）的免疫染色显示，ALB+肝细胞中RPS3显著增加，在1 dpi和3 dpi达到峰值。此外，肝细胞中RPS3的上调被氯膦酸盐处理显著消除。为了进一步研究活化的KCs是否能促进肝细胞中RPS3的富集，研究人员用来自TNF-α预处理的KCs的条件培养基（KCM）处理肝细胞，然后收集这些肝细胞来源的EVs（HEVs）。HEVs中RPS3表达的ELISA分析显示，与单独使用KCM处理相比，TNF‑α‑KCM处理增强了HEVs中的RPS3水平。对NSC分化的评估显示，TNF-α KCM处理的HEVs处理显著降低了少突胶质细胞和神经元的百分比。这些数据表明，活化的KCs介导的肝细胞中RPS3富集及其随后包装到EVs中抑制了NSCs向神经元和少突胶质细胞的分化。
2.5 肝脏中RPS3的敲低减弱了NSCs中NF-κB信号通路的激活
为测试KC来源的RPS3是否在介导NSC分化中起关键作用，研究人员通过siRNA敲低了KCs中的RPS3。通过免疫荧光确认了KCs中RPS3敲低的效率。然后，在存在TNF-α的情况下，收集来自这些RPS3缺失的KCs的EVs（TNF-α-KEVsiRPS3）。通过ELISA检测RPS3表达显示，TNF-α-KEVsiRPS3中RPS3的富集显著降低。随后，检测了这些TNF-α-KEVsiRPS3对NSCs分化的生物效应。免疫染色显示，RPS3的敲低显著消除了TNF-α-KEVs诱导的效应，增加了少突胶质细胞和神经元的百分比。这种效应可通过补充外源性RPS3来挽救。
为了靶向敲低肝脏中的RPS3表达，应用AAV8携带短发夹RNA通过尾静脉注射敲低肝脏中的RPS3。通过ELISA检测SCI后LEVs和PEVs中RPS3的表达以评估AAV8-shRPS3在肝脏中的效率，显示注射AAV8-shRPS3显著降低了1 dpi和3 dpi时LEVs和PEVs中RPS3的富集。此外，免疫染色显示，肝脏中RPS3的敲低也降低了NESTIN阳性NSCs中RPS3和P-P65的表达。这些数据表明LEVs通过器官间递送RPS3影响病变部位NF-κB信号通路的激活。此外，研究人员从AAV8-shRPS3注射的大鼠收集1 dpi和3 dpi的LEVs，并用这些LEVs处理NSCs，显示肝脏中RPS3敲低显著消除了1 dpi和3 dpi LEVs对介导NSC分化的相关效应，导致少突胶质细胞和神经元百分比的增加。
2.6 肝脏的器官间递送RPS3驱动星形胶质细胞的激活
鉴于LEVs和肝脏来源的RPS3被星形胶质细胞摄取，研究人员首先通过免疫染色检测这些EVs是否在体外影响星形胶质细胞的激活。结果显示，TNF-α KEVs和1 dpi-LEVs处理显著增加了C3的表达，并伴随A1相关基因表达和促炎细胞因子的上调。此外，在KCs和肝脏中敲低RPS3有效消除了这些TNF-α KEVs和1 dpi LEVs诱导的对星形胶质细胞激活的效应，导致C3阳性百分比、A1相关基因表达和促炎细胞因子的减少。重要的是，通过外源性RPS3补充可逆转这些效应，证实了它们对RPS3的特异性依赖。这些数据表明LEVs通过RPS3促进星形胶质细胞向A1型反应性星形胶质细胞极化。
接下来，研究人员将PKH-26标记的KEVsGFP-RPS3注射到SCI大鼠体内，GFAP免疫染色显示这些标记的KEVs被GFAP阳性星形胶质细胞摄取。随后，研究人员通过注射AAV8-shRPS3敲低肝脏中的RPS3表达，导致病变部位GFAP阳性星形胶质细胞中C3表达的减少。这表明肝脏来源的RPS3在星形胶质细胞激活中起关键作用。
鉴于星形胶质细胞极化在调节SCI后脊髓微环境及其对NSCs分化的影响中的关键作用，研究人员研究了LEVs刺激的星形胶质细胞是否会影响NSC命运。收集来自RPS3处理的星形胶质细胞的条件培养基（CM）并加入NSCs。免疫染色显示，与ACM处理的NSCs相比，加入RPS3处理的ACM显著降低了少突胶质细胞和神经元的比例。随后，研究人员用来自KEVs处理的星形胶质细胞、TNF-α KEVs处理的星形胶质细胞和TNF-α-KEVsiRPS3处理的星形胶质细胞的CM处理NSCs。与KEVs处理的ACM相比，TNF-α KEVs处理的ACM强烈抑制了NSC向少突胶质细胞和神经元的分化，而RPS3敲低消除了这种抑制作用。类似地，评估了来自LEVs处理的星形胶质细胞、1 dpi LEVs处理的星形胶质细胞和1dpi LEVsshRPS3处理的星形胶质细胞的CM。研究发现1 dpi LEVs处理的ACM显著降低了少突胶质细胞和神经元的分化，这种效应可通过敲低肝脏来源EVs中的RPS3来逆转。这些发现表明，富含RPS3的LEVs或KEVs促进了一种抑制SCI后NSCs向少突胶质细胞和神经元分化的星形胶质细胞表型。
2.7 肝脏中RPS3的敲低增强了轴突再生和髓鞘再生
为研究肝脏中RPS3的敲低是否影响轴突的再生和髓鞘再生，在损伤后第4周进行免疫染色。与SCI大鼠相比，注射AAV8-shRPS3的大鼠显著增加了GFAP阳性星形胶质细胞瘢痕边界内的TUJ1阳性神经元轴突区域。此外，注射大鼠中TUJ1和MBP双阳性髓鞘再生轴突的比例增加，表明靶向敲低肝脏中的RPS3增强了轴突再生和髓鞘再生。与组织学数据一致，AAV8-RPS3处理的小鼠在BBB评分和斜面测试中表现出改善，表明神经功能恢复更好。
2.8 血浆EVs中升高的RPS3与SCI严重程度和不良神经恢复相关
为研究RPS3是否与神经功能障碍程度相关，研究人员收集了SCI患者血浆中的EVs，并在入院时（3天内，初始AIS等级）评估神经功能。SCI患者被分为AIS等级A-D。测量PEVs中RPS3浓度显示，与对照组和AIS C-D患者相比，AIS A和AIS B患者中RPS3表达显著增加，表明循环RPS3水平与神经损伤严重程度相关。为了进一步研究PEVs中初始PRS3水平是否能预测神经恢复，研究人员在SCI后1个月重新评估了神经功能，发现在初始AIS A或AIS B患者中，那些表现出一个或多个AIS等级改善的患者，其PEVs中的RPS3显著低于未
