LncRNA KCNQ1OT1在高葡萄糖诱导的足细胞损伤中的表观遗传机制：通过m6A甲基化修饰发挥作用

足细胞损伤是糖尿病肾病的关键特征，本研究揭示LncRNA KCNQ1OT1通过招募MLL1增强WTAP启动子H3K4me3修饰，激活MAPK6/m6A信号通路加剧高糖诱导的足细胞损伤，沉默KCNQ1OT1可逆转该过程。

侯一凯|王丹丽|刘丽军|田家坤|志敏|史永兵

南京医科大学附属南京明基医院苏州明基中心肾脏科，中国苏州215010

摘要

足细胞损伤是糖尿病肾病的特征，与蛋白尿和肾功能障碍相关。本研究阐明了长链非编码RNA KCNQ1重叠转录本1（LncRNA KCNQ1OT1）在高糖（HG）诱导的足细胞损伤中的作用。在HG处理的足细胞中，测量了KCNQ1OT1、WTAP和MAPK6的表达水平。通过KCNQ1OT1干扰后，检测了细胞活力、凋亡、炎症和氧化应激。通过核-细胞质分离和RNA FISH确定了KCNQ1OT1的亚细胞定位。通过RNA pull-down和RIP验证了MLL1与KCNQ1OT1的结合。通过ChIP检测了WTAP启动子上的MLL1/H3K4me3富集。通过MeRIP测量了MAPK6的m6A水平。通过RIP确认了IGF2BP1与MAPK6的结合。 rescue实验探讨了WTAP/MAPK6轴在足细胞损伤中的作用。HG处理上调了足细胞中的KCNQ1OT1、WTAP和MAPK6表达。KCNQ1OT1敲低增强了细胞增殖，减少了凋亡，并减轻了炎症和氧化应激。机制上，核定位的KCNQ1OT1招募MLL1到WTAP启动子，增强了H3K4me3修饰和WTAP激活。WTAP促进了MAPK6 mRNA的m6A甲基化，该过程由IGF2BP1稳定。WTAP或MAPK6的过表达消除了KCNQ1OT1敲低对足细胞损伤的保护作用。总之，KCNQ1OT1通过m6A依赖的方式上调WTAP/MAPK6轴，从而加剧了HG诱导的足细胞损伤。

引言

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）的一种显著且严重的并发症，其发病率和患病率在全球范围内急剧上升[1]。氧化应激-炎症的恶性循环引发了DN病理中的肾细胞损伤，包括足细胞损伤[2]。足细胞是终末分化的上皮细胞，其裂隙隔膜决定了肾小球的滤过率和大分子的选择性过滤[3]。受损的足细胞导致肾小球滤过屏障的完整性受损，从而增加蛋白尿和异常的肾小球滤过率[4]。临床上，DN的管理包括药物干预以控制血糖、降低血压和调节血脂，而针对足细胞的疗法显示出有希望的策略[5]。在本研究中，我们通过用高糖（HG）处理足细胞建立了DN细胞模型，旨在识别DN中足细胞损伤的新机制。

长链非编码RNA（LncRNAs）作为重要的表观遗传调节因子，可调节染色质组织、RNA转录和剪接，并参与mRNA的运输、稳定性和翻译，以及蛋白质的稳定性和翻译后修饰[6]。LncRNAs的异常上调被认为是DN病理的重要表现，包括肾纤维化、氧化应激和线粒体损伤[7]。LncRNA Kcnq1重叠转录本1（KCNQ1OT1）在高糖诱导的肾小球系膜细胞和内皮细胞中高表达[8]。值得注意的是，沉默KCNQ1OT1可以缓解HG诱导的足细胞凋亡并抑制炎症[9]。LncRNA招募组蛋白甲基转移酶混合谱系白血病1（MLL1）到基因的启动子区域，诱导组蛋白H3的第4位赖氨酸的三甲基化（H3K4me3），并激活基因转录[10]。然而，现有的研究主要关注KCNQ1OT1在DN中的ceRNA机制[11]，尚未有研究探讨KCNQ1OT1通过组蛋白修饰参与足细胞损伤的作用。

N6-甲基腺苷（m6A）是一种由m6A甲基转移酶添加的内部共转录修饰，由去甲基酶去除，并被m6A结合蛋白识别，普遍存在于真核RNA中[12]。Wilms肿瘤1相关蛋白（WTAP）是m6A甲基转移酶复合体的关键组成部分，通过将m6A甲基转移酶复合体招募到目标mRNA上来参与m6A修饰[13]。在DN进展过程中，WTAP高度表达，并以m6A依赖的方式促进凋亡、线粒体损伤和炎症反应[14]、[15]、[16]。值得注意的是，WTAP启动子具有H3K4me3修饰，并受组蛋白修饰的调控[17]。我们假设LncRNA KCNQ1OT1招募MLL1到WTAP启动子，并影响H3K4me3修饰，从而参与DN的病理过程。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应是一种在物种间高度保守的信号通路，在将细胞外信号传递为各种细胞反应以维持稳态中起关键作用[18]。MAPK6是MAPK家族中的非典型成员，在DN中表达增加，并导致足细胞损伤[19]、[20]、[21]。数据库预测表明MAPK6含有m6A修饰位点，因此我们假设MAPK6是WTAP的下游靶标。

本研究旨在阐明LncRNA KCNQ1OT1/WTAP/MAPK6轴在DN发展中的机制，为DN的治疗提供更多理论见解。

部分摘录

细胞培养和处理

来自美国类型培养收集中心（ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯）的小鼠足细胞系MPC5在RPMI 1640培养基中维持，培养基中添加了10%的牛血清、100 U/mL的青霉素/链霉素和10 U/mL的重组小鼠IFN-γ（Sigma，密苏里州圣路易斯），在37°C和5% CO₂培养箱中培养。在葡萄糖处理中，细胞分别用5 mM葡萄糖（NG组）或30 mM葡萄糖（HG组）处理24、48或72小时。NG组还额外添加了25 mM的甘露醇（Sigma）

高糖诱导足细胞损伤并促进LncRNA KCNQ1OT1表达

作为评估LncRNA KCNQ1OT1在HG暴露的足细胞中功能的第一步，在HG处理后的指定时间点（0、24、48和72小时）测量了KCNQ1OT1的表达水平。如图1A所示，KCNQ1OT1在HG刺激后的表达水平随时间显著上调（p < 0.01），在48小时达到峰值，表明KCNQ1OT1在HG诱导的足细胞损伤中起关键作用。长期HG暴露导致细胞活力下降、

讨论

DN是糖尿病的一种高度普遍的并发症，可以通过组蛋白修饰和非编码RNA的表观遗传机制进行调节[26]。大量研究表明，LncRNAs通过参与糖尿病的主要病理过程（如氧化应激、炎症和纤维化）显示出作为治疗靶点的潜力[27]。在这里，我们发现了一种表观遗传机制，即LncRNA KCNQ1OT1通过H3K4me3组蛋白修饰激活WTAP转录，

CRediT作者贡献声明

侯一凯：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、数据管理、概念构建。史永兵：监督、方法学、正式分析。志敏：监督、方法学、概念构建。田家坤：方法学、研究、正式分析。刘丽军：可视化、研究、概念构建。王丹丽：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学、研究、数据管理、概念构建

资助

本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。