一种能够增强细胞壁从而促进发酵的真菌凝集素

时间:2026年1月16日
来源:Bioresource Technology

编辑推荐:

黑曲霉中新型岩藻糖结合凝集素FFSL通过增强细胞壁结构强化作用显著提升其热稳定性和抗逆性,使生物量增加35.3%和蛋白分泌效率提高86.26%,为工业发酵优化提供新策略。

广告
   X   

陈晨|苗佳熙|林博正|王拓凯|刘东阳|沈启荣
中国有机肥料重点实验室及江苏省固体有机废物利用重点实验室

摘要

在工业发酵过程中,尤其是以木质纤维素为底物的发酵中,丝状真菌的效率往往受到其菌丝在压力下的完整性的限制。增强细胞壁的强度是提高真菌性能的一种有前景的策略。通过对Trichoderma harzianum在稻草发酵条件下的转录组分析,发现一种新的岩藻糖特异性凝集素(FFSL)的表达显著上调。分子对接和等温滴定量热法证实FFSL对岩藻糖具有高亲和力(Kd = 5.24 μM),其结合过程由熵驱动。外源FFSL的应用重塑了菌丝细胞壁,热重分析和固态核磁共振(solid-state NMR)结果显示,纤维素含量增加了11.26%,乙酰化程度提高,同时基质成分如甘露糖和半乳糖的含量也有所上升。这种结构强化使得真菌具有更好的热稳定性和耐受性。因此,在稻草培养基上,FFSL处理使野生型和工程菌株的生物量分别增加了35.3%和24.96%。尤为显著的是,细胞外蛋白的产生显著增加,工程菌株的增加幅度达到了86.26%,这表明蛋白质分泌效率也得到了提升。FFSL通过与细胞表面岩藻糖的结合来增强细胞壁的强度。这一策略有效提高了Trichoderma harzianum在生物技术应用中的性能,为优化真菌细胞工厂提供了一种新的方法。

引言

Trichoderma属真菌是工业生物技术中的重要微生物细胞工厂,以其生产和分泌纤维素酶、半纤维素酶以及多种水解酶的能力而闻名。这些真菌能够高效利用多种底物,并表现出较高的生长速率和对环境变化的强适应性(Bhat, 2000; Kalogeris et al., 2003; Lima et al., 2024; Peng et al., 2022)。Trichoderma分泌的复杂酶系统在生物技术应用中至关重要,特别是在将木质纤维素生物质转化为可发酵糖类以生产生物燃料的过程中(Li et al., 2022; Lima et al., 2024; Xue et al., 2025)。在Trichoderma中表达重组蛋白的可行性与酶的分泌效率密切相关,因此人们一直在努力提高真菌的蛋白质分泌能力(Fang et al., 2021; Schuster and Schmoll, 2010)。
用于生产及分泌天然纤维素酶的高性能Trichoderma菌株通常是通过遗传改造来开发的,从而提高发酵效率(Fang et al., 2021)。这些策略包括对Trichoderma基因组的定向和非定向修饰,例如使用替代启动子、信号肽、优化的目标基因编码序列以及不同的终止子(Sun et al., 2020)。此外,发酵条件对Trichoderma的生长和代谢也有显著影响,包括发酵时间、温度、pH值和底物含水量等参数(Jung et al., 2015; Narra et al., 2012)。在高密度发酵过程中,一个关键但常被忽视的因素——分泌效率——变得越来越重要。在这种工业环境下,真菌细胞面临诸多环境压力,如营养限制、机械剪切力以及代谢副产物的积累(Amanullah et al., 2002; Bodie et al., 2021)。作为细胞与其外部环境之间的主要界面,真菌细胞壁是抵御这些不利条件的首道防线。其结构完整性不仅对生存至关重要,还与细胞形态和菌丝分支密切相关(Ost et al., 2025)。因此,一个坚固且适当重塑的细胞壁对于维持菌丝末端延伸和促进酶向培养基中的有效传输至关重要,从而直接影响整个过程的生产效率(El Enshasy, 2022; Veiter et al., 2018)。
有价值的蛋白质和酶的分泌必须穿过真菌细胞壁。越来越多的菌株改良策略涉及对细胞壁及其相关生物合成基因的修饰。与细菌相比,真菌细胞壁更为复杂且结构更为灵活,由多种多糖聚合物通过稀疏的共价键和大量的弱相互作用(如氢键)连接而成。电子显微镜下观察到的不溶性纤维的物理结构,以及纤维素和几丁质分子的化学结构和晶体排列,与植物细胞壁有显著相似之处(da Rosa et al., 2024)。真菌细胞壁的刚性支架主要由几丁质、β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖组成。这一结构被一层结构多样的外层所包裹,该外层可能介导与外部环境的相互作用(Garcia-Rubio et al., 2020; Mansour and Levitz, 2002; Student et al., 2024)。尽管细胞壁的动态组装和重塑(尤其是在应对发酵压力时)至关重要,但我们对其背后的分子机制的理解仍然有限。虽然参与关键细胞壁成分(如几丁质和β-葡聚糖)合成的核心生物合成酶已经得到了很好的研究(Brown et al., 2020),但调控这些过程的复杂调控网络和辅助因子仍不甚明了。关于非典型分子伴侣蛋白的功能也存在知识空白——这些蛋白在标准条件下可能不是必需的,但在确保细胞壁生物合成复合物的正确定位、稳定性和活性方面可能起着关键作用(Beauvais et al., 2014)。特别值得注意的是,目前尚无确凿证据表明存在具有特定糖结合能力的发酵相关分子伴侣蛋白;这样的蛋白可能能够直接与细胞壁前体或结构成分相互作用,但其功能机制仍不清楚。
在这项研究中,我们鉴定并表征了Trichoderma harzianum中的一种新蛋白质FFSL(真菌岩藻糖结合凝集素)。我们证明FFSL作为一种特定的分子伴侣蛋白,在高密度发酵条件下其表达显著上调。FFSL特异性地结合到真菌细胞壁中的岩藻糖含量丰富的成分上,这种相互作用在增强细胞壁完整性方面起着关键作用。重要的是,我们首次证明了FFSL介导的细胞壁强化与重组蛋白分泌效率显著提高之间的直接联系。我们的发现确立了FFSL作为一个先前未被认识的关键调控因子,为理解真菌如何动态调节其细胞壁以适应工业发酵环境提供了新的视角,并为培育高产菌株开辟了有希望的途径。

章节片段

Trichoderma harzianum菌株和转录组

所使用的Trichoderma harzianum菌株为CBS 226.95(https://www.uniprot.org/taxonomy/983964)。RNA文库由中国上海的OE Biotech, Inc.公司进行测序。我们感谢OE Biotech, Inc.(上海)在测序和/或生物信息学分析方面的协助。本文报告的原始序列数据已存入中国国家基因组数据中心/北京基因组研究所的基因组序列档案库

Trichoderma harzianum在稻草发酵过程中分泌FFSL

在稻草培养条件下,真菌会表达多种协同作用的蛋白质和辅助因子,这些因子在木质纤维素降解过程中起着重要作用(Couturier et al., 2012; Wang et al., 2016; Xiao et al., 2020)。Trichoderma harzianum在稻草发酵和营养丰富条件下的生理活性存在显著差异。在稻草发酵过程中,Trichoderma harzianum需要协调多种酶的作用来降解木质纤维素以获取养分

结论

本研究鉴定了一种新的岩藻糖结合凝集素FFSL,其在以木质纤维素为底物的发酵过程中在Trichoderma中表达上调。我们证明外源FFSL通过疏水相互作用识别岩藻糖并与真菌细胞壁结合。这种结合触发了细胞壁结构的全面重塑,表现为纤维素含量增加、乙酰化程度提高以及基质多糖含量上升

CRediT作者贡献声明

陈晨:撰写 – 审稿与编辑,撰写 – 初稿,实验研究,数据分析,概念构建。苗佳熙:撰写 – 审稿与编辑,撰写 – 初稿,实验研究,数据分析,概念构建。林博正:撰写 – 审稿与编辑,指导,实验研究。王拓凯:撰写 – 审稿与编辑,指导。刘东阳:撰写 – 审稿与编辑,指导,资源调配,项目管理,资金争取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金联合重点项目(U24A20627)、国家自然科学基金(32302679)、江苏省自然科学基金(BK20230991)以及中国博士后基金(项目编号2024M751440)的支持。

生物通微信公众号
微信
新浪微博


生物通 版权所有