Abstract
Purpose
新辅助化疗是晚期结直肠癌（CRC）根治性治疗的关键组成部分。然而，30%-40%的患者在治疗期间出现疾病进展，这凸显了需要预测工具来指导前期治疗选择。目前可扩展且可重复的患者分层方法仍然有限。微器官球体（MOS）是一种液滴封装的3D肿瘤模型，允许进行高通量功能性药物测试。本研究评估了肿瘤来源的MOS在预测CRC患者化疗反应方面的潜力。
Methods
从21名患者收集的37个原发和/或转移性肿瘤样本中生成MOS液滴。使用基于人工智能的影像分析量化MOS对化疗的反应，并与临床反应（RECIST/无病生存期[DFS]）和病灶特异性结局（病理反应/肿瘤体积变化百分比）进行比较。
Results
MOS化学预测试验显示出高度的可重复性（变异系数≤2.5%）。MOS药物敏感性重现了患者反应，在整个样本队列中准确率为83%，当来源于原发肿瘤时准确率达到100%。具有敏感MOS的患者表现出更长的DFS。单个MOS分析揭示了体外肿瘤内异质性的保留，并能够识别耐药克隆。
Conclusion
MOS技术提供了一个可扩展且稳健的功能性精准医学平台，有潜力指导CRC的临床决策。该平台准确预测患者对化疗的反应，并提供了对患者内和肿瘤内异质性的见解。
Introduction
结直肠癌（CRC）是第三大常见癌症类型，也是癌症相关死亡的第二大原因。晚期疾病的预后仍然很差，转移性病例的5年总生存率仅为14%。治愈性治疗可能结合手术以及双药或三药化疗。新辅助治疗可能改善手术结果，减少总化疗剂量，并降低局部复发的可能性。然而，其相对于辅助治疗的作用仍存在争议。标准化疗方案（输注性氟尿嘧啶（5-FU）、亚叶酸和奥沙利铂[FOLFOX]/5-FU、亚叶酸和伊立替康[FOLFIRI]/5-FU、亚叶酸、奥沙利铂和伊立替康[FOLFOXIRI]）的初始缓解率为60%，但在2年内疾病进展很常见。迄今为止，尚无经过验证的生物标志物能够可靠地指导化疗选择。因此，治疗决策仍然基于临床病理学特征和治疗史。这强调了对功能性检测的需求，这些检测可以预测个体患者的反应并实现个性化治疗决策。
患者源性肿瘤类器官（PDTOs）是模拟治疗反应的有价值工具。多项研究表明，PDTOs可以预测对化疗药物的临床反应。然而，由于获得足够生物量所需的时间、劳动力和成本密集型的工作流程以及对熟练人员的依赖，阻碍了其在临床实践中的采用，也妨碍了跨临床中心的标准化。因此，自动化检测对于将PDTO检测整合到常规诊断中至关重要。
本文展示了基于微器官球体（MOS）的功能性精准肿瘤学平台的临床效用，该平台使用微流控液滴封装解离的肿瘤细胞或PDTOs，实现标准化和自动化的患者特异性癌症模型生成和药物筛选。在概念验证数据的基础上，本研究将基于MOS的筛选应用于一个更大的回顾性临床注释CRC患者队列，以评估其指导临床决策的潜力。此外，我们使用基于影像的单个MOS分析来研究体外化疗反应的肿瘤内异质性。
Methods
Patients and Specimens
研究队列包括33名III期和IV期CRC患者，他们接受了标准护理的新辅助联合化疗，随后进行了根治性手术。该研究获得了当地医学伦理委员会的批准，所有患者均提供了书面知情同意书，用于数据和组织的收集与分析。共收集了66个原发和/或转移性切除肿瘤标本。
Tumor Tissue Processing and Ex Vivo Drug Sensitivity Testing
手术当天，肿瘤样本被解离并冷冻保存。解离的细胞被复苏并在肿瘤选择性培养基中扩增为PDTOs。PDTOs被扩增到足够的生物量，随后解离成单细胞，重悬于基质胶中，并使用MOS生成器V4.2打包成MOS液滴（每个MOS20个细胞）。恢复2天后，使用自动化液体处理器将MOS与荧光染料偶联的EpCAM抗体一起分配至384孔板（每孔40个MOS）。将5-FU、奥沙利铂和SN-38以九点剂量梯度作为单药和临床相关组合添加到板中。在第0、3和4天使用高通量共聚焦显微镜获取明场和荧光图像。从MOS生成到终点的测定总持续时间为7天。
MOS Drug Sensitivity Analysis
使用定制的深度神经网络模型从测定板的明场图像中分割单个MOS液滴。在分割生成的掩模内，计算每个MOS在每个时间点的EpCAM荧光积分，随后归一化到初始测定强度以校正测定起始时间点的生物量差异。通过计算每个药物处理条件相对于样本特异性载体对照和杀伤对照的存活率来确定体外药物敏感性。从每个样本和治疗的拟合剂量反应曲线计算pIC50值。随后将所有模型从敏感到耐药进行排序，产生MOS药物反应评分作为相对模型敏感性的度量。
Correlation With Patient Response and Statistical Testing
通过转移性肿瘤的影像学反应（≥20%生长=进展，符合RECIST阈值）和原发肿瘤的基于Dworak评分的病理消退（肿瘤消退等级[TRG]0=进展；TRG1-4=反应）来确定二元肿瘤水平临床反应。将临床反应与个体MOS药物反应评分相关联。使用Wilcoxon秩和检验比较反应组，并使用Benjamini-Hochberg方法对P值进行多重比较校正。实施了患者水平的置换分析，以考虑在同一患者贡献多个病灶的情况下零假设（无关联）下的非独立性。
进行受试者操作特征（ROC）分析以评估pIC50值区分临床反应的能力。在双正态模型下，通过Bootstrap重采样估计95%置信区间来计算AUC。
将MOS药物反应评分与患者水平从手术日期起的无病生存期（DFS）相关联，使用Kaplan-Meier可视化。使用Mantel-Cox对数秩检验比较组（≤50和>50百分位数）。使用Benjamini-Hochberg方法对P值进行多重比较校正。
Results
Validation of the MOS Functional Precision Oncology Screening Platform
本研究验证了MOS筛选平台的临床效用。自动化、高通量的筛选流程包括一个集成到机器人实验室工作流程中的MOSgen微流控设备。药物敏感性的读数使用基于人工智能的影像分析流程进行量化，该流程包括：（1）基于机器学习的液滴分割模型，从明场图像中分割每个MOS液滴；（2）信号提取方法，量化每个分割MOS液滴的荧光标记；（3）统计分析方泏，将提取的信号归一化以生成剂量反应曲线。为评估测定可重复性，在22周内对已建立的CRC PDTO MOS模型进行了35次体外化疗敏感性测定，由六名独立操作员进行筛选。所有测试的五种单药和药物组合的pIC50值的变异系数（CV）均≤2.5%（范围1.7%-2.5%），显著低于复杂细胞测定既定的可接受阈值<10%。基于这些结果，我们继续在一个临床注释的回顾性患者来源肿瘤样本队列中测试药物敏感性。
Establishing MOS Models From Tumor Samples Derived From Patients Treated With Neoadjuvant Chemotherapy
Clinical Sample Processing and MOS Generation
接受标准护理新辅助化疗的CRC患者的治疗后切除组织在手术当天被解离并作为单细胞冷冻保存。解离后中位存活率为65.5%，复苏后为58.7%，冷冻保存引起的中位变化为-4.7%。从复苏的肿瘤材料中建立PDTOs。39个PDTOs被处理成MOS液滴并随后进行药物筛选（MOS生成成功率：100%）。基于读数后筛选数据质控，两个被排除在下游分析之外（测定成功率：95%），剩下37个模型（来自21名患者）被纳入相关性分析。
Clinical Characteristics of Included MOS Models
在37个纳入的MOS模型中，25个来源于肝转移瘤，两个来源于淋巴结转移瘤，10个来源于原发肿瘤。大多数病灶来自诊断为UICC IV期CRC的患者，原发肿瘤的解剖部位为结肠（19/37，51%）和直肠（18/37）。25/37（68%）样本来自接受FOLFOX治疗的患者，6/37（16%）来自FOLFIRI治疗的患者，6/37（16%）来自FOLFOXIRI治疗的患者。对于10/21（48%）的患者，纳入了多个病灶。
PDTO Tumor Status Confirmation by Histology and Whole-Exome Sequencing
我们通过免疫组织化学证实了生成的PDTOs保留了原始CRC肿瘤组织的组织病理学特征。为了从遗传学上确认生成模型的肿瘤状态，对可获得的PDTO来源的DNA进行了全外显子组测序（n=34）。对于所有分析的模型，通过检测已知的CRC驱动突变确认了肿瘤状态。PDTOs中检测到的突变频率与转移性CRC样本报道的相当。APC、TP53和KRAS是队列中最普遍突变的基因（分别占样本的94%、62%和47%）。我们确认具有最高突变负荷的PDTO（S8）来自临床诊断为DNA错配修复缺陷的患者，确实携带致病性p.Arg621* MSH2突变。最后，对同一患者不同解剖部位获得的病灶进行测序揭示了共享的驱动突变，以及转移灶中病灶特异性的突变，表明转移灶在体内的持续遗传进化。
In Vitro MOS Response Recapitulates Patient Response to Chemotherapy
Determining MOS Droplet Drug Sensitivity
所有37个样本均评估了对联合化疗的敏感性，包括患者在其治疗过程中接受的疗法。通过计算每个药物处理条件相对于载体和杀伤对照的EpCAM荧光强度相对存活率，并拟合剂量反应曲线来确定体外MOS模型敏感性。通过对所有筛选样本的每种化疗方案的pIC50值从最敏感（0%）到最耐药（100%）进行排序来量化反应，建立MOS药物反应评分。我们将MOS敏感性与患者接受的方案以及替代的奥沙利铂为基础（FOLFOX）或伊立替康为基础（FOLFIRI/FOLFOXIRI）的方案进行了比较。大多数MOS模型对任一方案表现出相似的敏感性，而其他模型则对某一特定化疗方案表现出偏好敏感性。这表明，在临床环境中，可能会预期对这些不同方案的差异反应。
Correlation of MOS Response With Clinical Patient Response
接下来，将体外MOS反应与病灶特异性临床结局相关联，通过仅在筛选后发布临床数据确保操作员盲法。我们整合了原发肿瘤的金标准病理评估（提供肿瘤消退的直接测量）和转移性环境中实用的实时影像学反应（其中TRG通常不可用）。
基于MOS的体外反应重现了病灶特异性临床反应，在患者水平分析中，显示临床进展的样本中观察到统计学上显著更高的化疗耐药性。在考虑患者水平置换检验的簇内相关性后，MOS反应与临床结局之间的关联在所有样本和原发肿瘤中仍然显著，但在转移性肿瘤中不显著。此外，我们尝试了三分类，区分轻度反应、强烈反应和进展。病灶水平分析显示，在整个队列中，轻度反应组和强烈反应组与进展组之间存在显著差异，这些差异在患者水平置换分析后仍然保持。
ROC分析显示，该测定在区分应答者与非应答者方面，在整个队列中AUC为0.86。在预设的平衡敏感性和特异性的截断值下，该测定显示83%的准确率。对于转移灶，AUC为0.81，准确率为76%。当仅基于原发肿瘤样本预测临床反应时，测定性能达到100%的准确率。
使用DFS，在患者水平而非病灶水平评估相关性。使用MOS药物反应评分在50百分位数处的截断值将MOS模型分类为敏感或耐药。在所有合并患者、仅取样转移灶患者和仅取样原发灶患者中，应答者组的中位DFS较高。应答者和非应答者的分离在Kaplan-Meier图中也可见。结果在患者水平对数秩检验中不具统计学显著性，在随后的患者水平置换分析后也不显著。这表明尽管当前研究中存在明显趋势，但需要更大的患者队列来建立统计学显著性。总之，这些发现表明患者来源的MOS模型准确地重现了临床反应，并突出了基于MOS的测定用于患者分层的潜力。
Multilesion Analysis Reveals Intrapatient Heterogeneity
对10名患者获得了来自不同解剖位置的多个病灶的MOS化学敏感性数据，从而能够检测患者内病灶特异性的药物反应差异。对于收集了≥2个样本的10名患者中的7名，无论测量哪个样本，临床反应的预测都是准确的。第11名患者无论纳入哪个病灶都会被错误分类为非应答者。对于其余两名患者，预测是否准确取决于测试了哪个病灶。最后，对于该亚队列中所有获得原发肿瘤样本的患者（n=4），原发肿瘤始终能准确预测临床反应。这一观察结果对于潜在的未来临床应用特别相关，因为原发肿瘤提供了最早的CRC组织病理学确认。
Single MOS Analysis Enables Detection of Intratumoral Heterogeneity in Chemotherapy Response
Intratumoral Heterogeneity Quantification Using Single MOS Analysis and Identification of Drug-Resistant Clones
为了探索MOS是否可用于测量一个样本内药物反应的异质性，我们使用在MOS水平分割的图像来计算单个MOS相对存活率。我们将此存活率相对于载体对照二甲基亚砜（DMSO）和星形孢菌素处理的杀伤对照进行归一化。正如预期，单个MOS的中位存活率信号随着化疗浓度的增加而降低。有趣的是，在每个处理的孔内观察到MOS存活率的广泛分布，表明来自同一肿瘤样本的PDTOs保持了异质的药物反应，这一发现与之前的研究一致。将单个MOS水平的存活率得分投射到明场图像上，视觉上证实了来自单个样本的MOS中这种异质的肿瘤细胞生长。
在高化疗剂量下，一些测试样本显示出 outlier MOS，这些MOS在测定终点表现出高存活率，表明尽管存在对大多数邻近肿瘤细胞有毒的化疗浓度，这些MOS内的肿瘤细胞继续增殖。检查这些看似耐药的MOS的明场图像提供了视觉确认，表明它们比大多数对应物含有更高的生物量。这一观察结果说明了MOS平台在体外捕获和模拟药物反应肿瘤内异质性的潜力。
MOS Phenotyping via Brightfield Imaging
基于明场成像训练的机器学习模型可以预测细胞和疾病表型，并越来越多地用于药物开发。在这里，我们询问明场成像是否可以捕获药物反应MOS表型。使用Uniform Manifold Approximation and Projection（UMAP）算法可视化单个MOS图像的DINOv2嵌入，揭示了终点MOS图像的治疗特异性（载体对照、杀伤对照和FOLFOXIRI）聚类。从UMAP不同区域裁剪的单个MOS图像确认了高增殖性、部分停滞和生长停滞MOS的预期形态特征。仅基于明场成像，先前通过EpCAM测量识别的FOLFOXIRI耐药 outlier MOS，与DMSO处理的MOS聚类更近，而不是与中位FOLFOXIRI或星形孢菌素处理的MOS。除了生物学表型，技术因素如MOS位置、移动、气泡或板处理不当也被捕获。这些结果表明，监督模型可能最终实现仅通过明场读取MOS药物反应，提供一种低成本、可扩展的活体成像测定。
Discussion
我们之前提供了概念验证数据，表明基于MOS的体外筛选重现了化疗的临床反应。在这里，我们将基于MOS的功能性精准医学应用于一个更大的回顾性CRC患者队列，以验证其指导临床决策的潜力。
体外MOS药物测试重现了病灶特异性对标准护理化疗的临床反应，准确率为83%，超过了经典CRC PDTOs报道的汇总准确率。这种优越的性能可能反映了该测定已证明的可重复性和标准化。对于原发肿瘤，该测定显示出100%的敏感性和100%的特异性，尽管是在一个有限的队列中。这种差异可能反映了原发肿瘤更高的克隆复杂性，包含更多敏感克隆，或转移灶先前治疗的负担更重。
对标准护理方案的耐药是晚期CRC的主要临床挑战。广泛的临床前工作试图识别对化疗或靶向治疗的耐药机制。通过实现耐药MOS的高通量、活体成像，我们的方法提供了一种可扩展的方法来研究肿瘤内异质性并剖析耐药的基本机制。此外，耐药评分可能在未来的研究中为患者结局提供额外的精确性。
总之，这些发现支持了MOS平台作为决策工具的临床潜力，该工具可以通过个体化患者旅程来提高反应率。
尽管结果令人鼓舞，但本研究的局限性包括队列规模适中且临床特征异质性，这可能限制当前研究的普适性。需要在更大的队列中进行前瞻性研究来验证基于MOS的筛选的预测潜力。尽管在标准化和自动化方面取得了技术进步，但监管和报销障碍仍然是临床实践采用的障碍。
此外，未来的研究将集中于直接从原发解离的肿瘤细胞建立MOS，进一步缩短诊断环境中的周转时间。而且，直接从肿瘤组织生成的MOS保留了肿瘤微环境（TME）的非肿瘤成分，并进一步降低了遗传漂变和选择的风险。这将使得能够评估涉及TME的疗法（如免疫检查点抑制剂或靶向TME的抗体）以杀死肿瘤细胞。
