柿子多酚氧化酶的生化性质研究：三相分配、动力学分析及抑制机制

本研究采用三相分配法高效纯化柿子多酚氧化酶（PPO），获得分子量约63 kDa的纯酶，动力学分析显示儿茶酚和4-甲基儿茶酚为最适底物，酶活性在氯仿等有机溶剂中稳定，验证了TPP方法在食品褐变抑制中的应用潜力。

作者：Yonca Yuzugullu Karakus、Elif Kale Bakir、Didem Ulgut Sakallioglu、İlayda Candan、Aysegul Yoruk

土耳其科贾埃利大学文理学院生物系，41001伊兹密特，科贾埃利

摘要

多酚氧化酶（PPO）首次通过三相分离法（TPP）从柿子（Diospyros kaki Thunb.）中纯化出来，纯化效率达到120%。纯化的PPO分子量约为63 kDa，对邻-二酚、对-二酚和三酚具有催化活性，但不具有单酚氧化酶活性。该酶在较宽的pH范围内表现出较高的稳定性，并具有中等的热稳定性。动力学分析表明，儿茶酚和4-甲基儿茶酚（4MC）是最有效的底物。PPO对抗坏血酸、苯甲酸和硫脲敏感，但其活性可被Cu²⁺增强。研究还发现，PPO在多种有机溶剂中仍能保持其活性，尤其是在氯仿中。结果表明，TPP法是一种高效、经济且环保的PPO纯化方法，同时为防止含柿子食品发生酶促褐变提供了重要信息。

引言

随着人们对食物对健康影响的认识不断加深，营养学、产品创新和大规模生产得到了快速发展。功能性食品这一新兴类别应运而生，这类食品通过改善健康状况来降低疾病风险。功能性食品和药用化合物来源于多种天然资源，其中生物活性物质赋予了它们药用功效。水果和蔬菜是人类饮食的重要组成部分，富含生物活性化合物，如植物化学物质、天然抗氧化剂和膳食纤维。柿子（Diospyros kaki L.）是一种营养价值高的水果，含有多种生物活性成分，包括矿物质、膳食纤维、多酚、萜类化合物、类黄酮和类胡萝卜素，这些成分使其具有显著的抗氧化特性（Butt等人，2015；Yaqub等人，2016）。

柿子是一种热带落叶水果，果肉多汁且富含纤维，属于柿树科（Ebenaceae）。全球多个温暖地区都有柿子种植，包括巴西、中国、意大利、韩国和土耳其（Butt等人，2015）。在土耳其，柿子被称为特拉布宗柿子（Diospyros kaki Thunb.），因为它是通过特拉布宗引入该国的。柿子以其抗氧化特性和预防退行性疾病的能力而闻名，同时富含钙、钾、维生素A和维生素C（Núñez-Delicado等人，2003）。柿子中的单宁含量较高，还含有多种抗氧化酚类化合物，这些化合物能够降低慢性疾病风险并保护组织免受自由基损伤（Gorinstein等人，1994）。此外，柿子籽提取物也具有很强的自由基清除能力（Ahn等人，2002）。研究表明，单宁具有抗突变、抗癌和抗氧化作用（Gali等人，1992）。因此，柿子因其独特的风味、丰富的酚类化合物和较高的抗氧化能力而受到关注。

柿子分为涩味型和非涩味型（Núñez-Delicado等人，2003）。涩味是由于果实成熟时单宁含量较高所致（Özen等人，2004）。市场上的涩味柿子在去除涩味后即可食用，但此时果实会出现褐变现象；与非涩味柿子自然去除涩味后的褐变程度相似（Núñez-Delicado等人，2003）。无论哪种情况，褐变都会降低柿子的营养价值、破坏外观并影响食用安全性（Liu等人，2023；Navarro等人，2014）。

先前的研究指出，多酚氧化酶（PPO）在引发褐变反应中起关键作用（Derardja等人，2024；Sui等人，2023）。PPO通过一系列化学反应导致果实褐变，首先催化单酚氧化生成儿茶酚（EC 1.14.18.1），随后儿茶酚进一步氧化为相应的邻-醌（EC 1.10.3.1）（Derardja等人，2024）。醌是一种反应性亲电化合物，可自聚（Marusek等人，2006；Torres等人，2021），或与巯基、酚类和胺类等亲核试剂发生共价反应，形成高分子量的棕色或黑色色素，尤其是黑色素（Altunkaya & Gökmen，2012；Aydin等人，2015；Torres等人，2021）。

研究人员致力于研究PPO的分子和生化特性，以减少酶促褐变带来的负面影响（Sui等人，2023）。已有大量关于从香蕉、苹果、杏子、菠萝、桃子、樱桃、橄榄、栗子、土豆和梨等水果中纯化PPO的论文（Aydin等人，2015；Derardja等人，2017；Kader等人，1997；Liu等人，2024；Panadare & Rathod，2018；Zaini等人，2012；Zhou等人，2018）。然而，关于柿子中PPO作为抗氧化剂的的研究较少，且结果存在分歧。Núñez-Delicado等人（2003）发现，介质中十二烷基硫酸钠（SDS）的存在会影响PPO的活性，最佳pH值分别为无SDS时低于3.5，有SDS时低于5.5。相反，Özen等人（2004）和Navarro等人（2014）认为PPO的最佳活性pH值分别为7.5和5.5。这些研究均未报道PPO的纯化过程，但通过聚丙烯酰胺凝胶发现了多种PPO异构体（Navarro等人，2014；Núñez-Delicado等人，2003；Özen等人，2004）。鉴于不同酶异构体之间的生化性质可能存在差异，详细研究柿子PPO的生化特性对于防止酶促褐变至关重要，这需要获得高纯度的PPO。

本研究旨在开发一种从柿子中纯化并表征PPO的方法。选择三相分离法（TPP）是因为该方法能够快速高效地一步完成生物分子的纯化。在TPP过程中，目标酶或蛋白质被选择性地分配到一个相中，而污染物则分配到另一个相中，从而实现酶的纯化和浓缩。提取过程涉及介电效应、盐析作用、等离子共溶剂相互作用以及蛋白质的渗透压沉淀（Akardere等人，2010）。TPP法适用于粗提物的纯化和浓缩，适用于从小规模到大规模的应用。该方法操作简便、环保、成本低廉、可在室温下进行，并且相比传统色谱法使用更少的溶剂（Dennison & Lovrien，1997）。具体步骤包括向粗提物中加入无机盐（通常是硫酸铵），然后与有机溶剂（如叔丁醇）混合。叔丁醇的加入使混合物分为三个相：上层为密度较大的叔丁醇相，下层为水相，中间相为含有蛋白质的沉淀物（Dennison & Lovrien，1997）。TPP法已用于多种酶的纯化，如转化酶（Akardere等人，2010；Özer等人，2010）、α-半乳糖苷酶（Bayraktar & Önal，2013）、R-藻红蛋白（Wang等人，2023）、乳凝蛋白酶（Maskey & Karki，2024）、过氧化物酶（Chen等人，2022；Yuzugullu Karakus等人，2018）和漆酶（Yuzugullu Karakus等人，2025）。尽管有关利用TPP从植物提取物中纯化多酚氧化酶的研究较少（Alici & Arabaci，2016；Niphadkar & Rathod，2015；Yuzugullu Karakus等人，2020；Yuzugullu Karakus等人，2021），但据我们所知，目前尚无关于用TPP从水果中纯化PPO的数据。

本研究通过化学和物理手段控制酶促褐变，有助于减少柿子的营养损失。将酸性灭活与特定抑制剂结合使用，可为储存和食品加工过程中的褐变问题提供理论和实践上的解决方案。

材料

10月份从土耳其德尼兹利的本地供应商处获取了柿子（Diospyros kaki Thunb.）样品。去除果实的外皮后，仅保留果肉部分并储存在-80°C条件下。

实验中使用的化学品主要从Sigma-Aldrich（德国）购买。聚维酮（PVPP）从Duchefa Biochemie（荷兰）购买。电泳中使用的标记物来自Bio-Rad（美国）。

粗提物的制备

柿子PPO的纯化

本研究采用三相分离法（TPP）和色谱纯化法从柿子提取物中有效纯化了PPO，并比较了两种方法的效率。

生物分子在TPP系统中的分布行为是一个复杂现象，受多种因素影响（Dennison & Lovrien，1997）。研究了不同参数对PPO分布的影响。

结论

本文详细介绍了利用三相分离技术（TPP）从柿子中纯化PPO的方法及其生化特性。作为一种低成本、操作简便、可扩展且环保的纯化方法，该方法为生化分析提供了可靠的基础，因为酶的活性得到了较好保留。从柿子中纯化的PPO表现出良好的生化特性，如较高的热稳定性和pH稳定性。

作者贡献声明

Yonca Yuzugullu Karakus：撰写初稿、数据可视化、结果验证、项目管理、方法设计、实验设计、资金申请、数据整理、概念构思。Elif Kale Bakir：数据可视化、软件应用、方法设计、实验实施、数据分析。Didem Ulgut Sakallioglu：实验设计。İlayda Candan：实验实施。Aysegul Yoruk：实验实施。

未引用的参考文献

Dhananjay和Mulimani，2009

Galeazzi和Sgarbieri，1981

Lineweaver和Burk，1934

de Oliveira Carvalho和Orlanda，2017

Whitaker，1995

Yerlitürk、Arslan、Sinan、Gencer和Özensoy，2008

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢科贾埃利大学（项目编号：FAA-2024-4120）提供的资金支持。