从外皮到核心：通过宏基因组学和响应面分析，探究盐分和成熟温度如何影响绵羊奶酪中的微生物生态

传统葡萄牙生羊奶酪微生物生态受盐浓度和成熟温度影响研究。通过四水平盐浓度（0%、2%、4%、6%）和三温度（8℃、11℃、14℃）的因子设计，结合宏基因组测序和培养计数，发现表面假单胞菌属占优，内部乳杆菌属占主导，真菌在低温低盐和高温高盐条件下均富集，验证了乳杆菌生态稳定性。

西蒙娜·洛佩斯（Simone Lopes）|曼努埃拉·维达（Manuela Vida）|克劳迪娅·科雷亚（Cláudia Correia）|海梅·费尔南德斯（Jaime Fernandes）|桑德拉·戈麦斯（Sandra Gomes）|安娜·费尔南多（Ana Fernando）|拉斐尔·塔布拉（Rafael Tabla）|费尔南达·西蒙尼斯（Fernanda Simões）|安杰拉·洛佩斯（Ângela Lopes）|特蕾莎·诺盖拉（Teresa Nogueira）|努诺·阿尔瓦伦加（Nuno Alvarenga）

NOVA科学技术学院，NOVA里斯本大学，2829-516，卡帕里卡（Caparica），葡萄牙

摘要

本研究探讨了盐浓度和成熟温度如何影响一种以传统葡萄牙手工制奶酪工艺为灵感制作的生羊奶奶酪的微生物生态。实验采用了因子设计，设置了四种盐浓度（0%、2%、4%和6%）和三种成熟温度（8°C、11°C和14°C）来生产这种手工风格的奶酪。宏基因组测序结果显示，奶酪外皮和内部样本的微生物组成存在差异：外皮中以假单胞菌属为主，而内部则以乳酸菌（LAB）为主。在成熟20天后，α多样性和β多样性分析未显示出处理组间的显著差异，表明乳酸菌具有生态韧性；而真菌种群则表现出非线性响应，在低温低盐和高温高盐条件下均能生长。这些发现突显了乳酸菌的稳定性和真菌的适应性，为优化成熟参数以保持微生物平衡、感官品质和葡萄牙原产地命名（PDO）奶酪的典型特征提供了依据。

引言

传统的生羊奶奶酪是葡萄牙美食传统的象征，融合了手工技艺、微生物多样性和鲜明的地域特色。诸如Serpa、Évora、Castelo Branco、Serra da Estrela和Azeitão等受保护的原产地命名（PDO）奶酪，其品质和独特性源于生奶、植物凝乳剂（Cynara cardunculus L.）以及本土微生物生态系统之间的相互作用（Araújo-Rodrigues等，2020；Cardinali等，2021；Rocha等，2021）。

在此背景下，本研究采用了一种以传统葡萄牙手工制奶酪工艺为灵感制作的生羊奶奶酪作为实验模型。该模型旨在反映几种葡萄牙生羊奶奶酪的共同技术特征，包括使用生奶、不添加发酵剂，并在受控的温度和盐度条件下进行成熟，但并不旨在完全复制任何一种PDO奶酪的具体规格。这种方法使得在标准化和可重复的条件下研究微生物生态机制成为可能。

本土微生物群落受到生奶、环境和技术因素的强烈影响，在酸化、蛋白质分解、脂肪分解以及产生赋予奶酪独特香气和质地的挥发性化合物过程中起着关键作用（Montel等，2014；Serrano等，2024a）。由于未经过巴氏杀菌处理且使用了植物凝乳剂，这些奶酪的微生物多样性更为复杂，这引入了较高的微生物和生化变异性（Araújo-Rodrigues等，2022，2023）。最近对葡萄牙PDO奶酪的研究表明，细菌群落以乳酸菌为主，主要包括Lactococcus lactis、Leuconostoc mesenteroides、Enterococcus faecalis和Lactobacillus plantarum；而酵母和霉菌如Debaryomyces hansenii、Kluyveromyces marxianus、Geotrichum candidum和Yarrowia lipolytica则参与奶酪外皮的形成和香气的发展（Coelho等，2023；Gonçalves Dos Santos等，2017；Gonçalves等，2018）。

利用分子生物学和高通量测序（HTS）技术对葡萄牙奶酪的研究揭示了PDO与非PDO产品之间以及不同生产季节之间的细菌和真菌多样性差异（Gonçalves Dos Santos等，2017；Rocha等，2021）。下一代测序（NGS）的应用发现了许多无法培养或数量较少的微生物物种，表明微生物组成与成熟过程中的盐浓度、温度和湿度等技术和环境变量密切相关（De Filippis等，2024；Santamarina-García等，2024）。

在成熟的羊奶奶酪中，外皮和内部形成了两个不同但相互依存的生态位。外皮暴露在氧气、脱水和盐分环境中，主要栖息着Brevibacterium、Corynebacterium、Staphylococcus、Psychrobacter以及多种耐盐酵母等需氧微生物。这些微生物与色素沉着、挥发性化合物的产生和微生物抗性有关（De Filippis等，2024；Irlinger等，2025；Saak等，2023）。相比之下，内部环境为微需氧且更稳定，主要由乳酸菌主导，其发酵和蛋白质分解活动决定了奶酪的pH值、质地和稳定性（Rocha等，2021；Serrano等，2024a）。因此，理解这些部分之间的生态相互作用对于控制成熟过程和感官品质至关重要。

在影响奶酪微生物群落的技术因素中，氯化钠（NaCl）和成熟温度尤为重要（Lopes等，2025）。盐分调节水分活性，作为选择剂抑制革兰氏阴性菌和腐败真菌，同时调节乳酸菌的生理活动和渗透压平衡（Montel等，2014；Rocha等，2021）。温度则控制发酵动力学、蛋白质分解速率以及乳酸菌、酵母和嗜冷细菌的生长（Araújo-Rodrigues等，2022；Gonçalves等，2018）。针对Serpa和Serra da Estrela等葡萄牙奶酪的研究表明，这些参数的变化会显著影响成熟过程中的微生物多样性和演替，最终影响奶酪的质地和风味（Rocha等，2021；Serrano等，2024a）。

宏基因组学和多组学方法的发展使得能够整合分类学、功能学和环境数据，以解析发酵食品中的微生物相互作用（Bottari等，2020；De Filippis等，2024；Saak等，2023）。鸟枪法宏基因组学能够识别与蛋白质分解、耐盐性和挥发性化合物生物合成相关的基因，提供微生物结构和活动的全面视图。这些技术已成功应用于伊比利亚和地中海奶酪的研究，但在葡萄牙生羊奶奶酪中的应用仍较为有限（Gonçalves等，2018）。

尽管宏基因组学在奶酪微生物群落研究方面取得了显著进展，但依赖培养的方法对于量化活菌数量和评估其技术行为仍至关重要。在传统生奶奶酪中，这两种方法相辅相成：基于DNA的测序提供了微生物结构的全面视图，而基于培养的计数方法则直接测量了驱动外皮发育和表面发酵的活性酵母、霉菌和乳酸菌的数量。

本研究旨在探讨不同盐浓度和成熟温度如何影响这种传统风格生羊奶奶酪的微生物生态，从外皮到内部。为此，我们结合了16S宏基因组学来分析外皮和内部的细菌群落结构，并通过培养方法计数外皮中的活性酵母、霉菌和乳酸菌。这种综合方法提供了结构和功能的互补视角，有助于全面评估不同奶酪部分和技术条件下的微生物动态，从而促进葡萄牙传统生奶奶酪的科学和技术价值。

基于先前的研究（Araújo-Rodrigues等，2022；Montel等，2014；Rocha等，2021），我们假设这些技术因素会对外皮和内部的微生物动态产生不同影响。我们进一步预期，在传统生羊奶奶酪中具有生态韧性的本土乳酸菌在不同成熟条件下相对稳定（Coelho等，2023；Gonçalves等，2018；Serrano等，2024b）。因此，本研究探讨了盐度和温度如何共同影响奶酪各部分的微生物结构和活力。

实验设计与接种

奶酪制作采用标准化的人工工艺协议进行，遵循传统的葡萄牙生羊奶奶酪技术。过程包括使用生羊奶、不添加发酵剂直接凝固、手工处理凝乳以及根据实验设计进行干燥加盐。通过因子实验设计研究了盐浓度和成熟温度对微生物的影响

细菌群落结构

宏基因组分析显示，奶酪外皮和内部样本的微生物组成存在差异（图1），反映了成熟过程中形成的不同理化梯度。这种空间分离导致了不同的微生物组成：外皮中以假单胞菌属为主，而内部则以乳酸菌（Lactococcus、Leuconostoc、Lactobacillus和Enterococcus）为主。

为了评估微生物多样性对实验因素（如奶酪层次）的反应

细菌群落结构

假单胞菌属在奶酪表面的优势与其强大的定殖能力、生物膜形成以及分泌耐热蛋白酶和脂肪酶等细胞外酶有关，这些特性使其在低温和有氧条件下具有竞争优势（Irlinger等，2025；Montel等，2014）。Pseudomonas fluorescens在中性pH值和低糖竞争环境中生长旺盛，这正是奶酪外皮的特征。外皮暴露在氧气和脱水中，为微生物活动提供了适宜环境

结论

本研究结合了宏基因组学和响应面建模方法，探讨了盐浓度和成熟温度如何影响一种手工风格生羊奶奶酪的微生物生态。宏基因组学揭示了外皮和内部的细菌群落结构，而基于培养的计数方法提供了外皮中活性真菌和乳酸菌的定量信息，有助于对微生物对技术条件的响应进行功能建模。

在成熟20天后

CRediT作者贡献声明

西蒙娜·洛佩斯（Simone Lopes）：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学研究，概念化。曼努埃拉·维达（Manuela Vida）：验证，方法学研究。克劳迪娅·科雷亚（Cláudia Correia）：方法学研究。海梅·费尔南德斯（Jaime Fernandes）：撰写 – 审稿与编辑，方法学研究。桑德拉·戈麦斯（Sandra Gomes）：撰写 – 审稿与编辑，监督。拉斐尔·塔布拉（Rafael Tabla）：撰写 – 审稿与编辑，项目管理。费尔南达·西蒙尼斯（Fernanda Simões）：撰写 – 审稿与编辑，方法学研究。安杰拉·洛佩斯（Ângela Lopes）：

资助

本研究由项目0100_TID4AGRO_4_E资助，该项目得到了欧洲区域发展基金（ERDF）通过欧盟委员会的INTERREG VI-A西班牙-葡萄牙（POCTEP）2021–2027计划的支持。此外，该研究还获得了FCT - 科学与技术基金会的358号资助，资助范围包括研究单位UIDB/04035/2020（GeoBioTec研究中心）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢Ferrolho & Ferrolho, Lda.提供用于本研究的羊奶。