摘要
芍药内酯苷（albiflorin）和芍药苷（paeoniflorin）是中药白芍（Paeoniae Radix Alba）中的一对生物活性异构体。其准确定量对药理研究至关重要。常规液相色谱-质谱（LC-MS）分离方法常使用含0.1%甲酸的流动相，但本研究发现，该条件会导致芍药内酯苷产生一个质荷比（m/z）和碎片模式均与主峰相似的次级峰。为解决此问题，本研究开发了一种使用Kinetex苯基-己基色谱柱的LC-MS方法，采用水相为10 mM醋酸铵和醋酸缓冲液（pH 4.4）、有机相为甲醇的梯度洗脱体系。该方法经验证具有良好的线性、精密度、准确度和灵敏度，成功分离了芍药苷和芍药内酯苷，并避免了芍药内酯苷假峰的形成。线性范围为1–50 μg/mL。通过对白芍提取物的分析验证了方法的适用性。所开发的LC-MS方法通过消除芍药内酯苷的第二个峰，实现了对两者的准确同步定量，使其可能适用于白芍及其他含此二成分植物的药理研究。
引言
芍药内酯苷和芍药苷是单萜苷类化合物，存在于常用中药白芍（芍药Paeonia lactiflora的根）的提取物中。药理研究表明，二者均具有重要的健康益处。芍药内酯苷具有抗炎、抗氧化、神经保护（Fang et al. 2023; Ho et al. 2015; Ma et al. 2021; Park et al. 2025; Xu et al. 2019）和肝保护（Liu et al. 2024; Song et al. 2024）特性。芍药苷同样表现出抗炎（Wang et al. 2014）和抗氧化（He and Dai 2011）作用，此外还具有免疫调节（He and Dai 2011）和造血（Zhu et al. 2016）特性。对这些化合物的可靠准确定量对其药理研究至关重要。
液质联用（LC-MS）因其高灵敏度和特异性，是分析植物提取物等复杂混合物的首选方法。芍药内酯苷和芍药苷是结构异构体，这使它们的色谱分离具有挑战性。现有的分离方法主要采用反相（C18）色谱柱和添加0.1%甲酸的水与乙腈组成的流动相。然而，在本研究尝试复现这些方法时，观察到芍药内酯苷色谱图中出现一个微小的第二峰，该峰在主峰之后几分钟洗脱，并显示出相似的MS和MS2 谱图。深入研究发现，0.1%甲酸的存在持续导致该副峰的形成。但完全去除甲酸又会导致两个异构体之间的色谱分离度下降。因此，本研究探索了使用缓冲流动相。有文献使用乙腈和pH 3.0的5 mM磷酸钠缓冲液分离芍药内酯苷和芍药苷，但磷酸盐缓冲液因其低挥发性而不适用于LC-MS。最近，有研究描述了使用挥发性醋酸铵缓冲液结合0.1%甲酸定量分析芍药苷的LC-MS方法，但未研究芍药内酯苷和芍药苷的分离。针对这一空白，本研究开发了一种使用水相为10 mM醋酸铵和醋酸（pH 4.4）、有机相为甲醇的流动相的方法。该方法既能分离芍药内酯苷和芍药苷，又能防止酸诱导的芍药内酯苷假峰形成，从而实现准确定量。
实验部分
2.1 化学品与植物材料
LC-MS分析所用溶剂（LC-MS级）购自Fisher Chemicals。醋酸铵（Optima, LC-MS级）和冰醋酸（实验室试剂级）也购自Fisher Chemicals。甲酸（99%–100%）购自VWR Chemicals。
氘代甲醇和氘代二甲基亚砜购自Sigma-Aldrich。
芍药苷和芍药内酯苷标准品（纯度均>98%）购自Cayman Chemicals，另一样芍药内酯苷标准品（>97%）购自PhytoLab GmbH & Co. KG。所有标准品均溶于乙醇（≥99.5%）。
白芍（Bai Shao Yao）由Chinasan GmbH & Co. KG提供。提取用甲醇（HPLC级）购自Fisher Chemicals。
2.2 仪器与分析方法
LC-MS分析使用UltiMate 3000液相色谱仪与LTQ XL质谱仪联用系统。分离采用Kinetex苯基-己基色谱柱（150 × 2.1 mm × 2.6 μm）。流动相初始为含0.1%甲酸的甲醇（A）和水（B），后改为甲醇（A）和用10 mM醋酸铵及冰醋酸缓冲至pH 4.4的水（B）。两种情况下均使用以下梯度，流速250 μL/min：0–1 min 95% B，1–2 min 95%–60% B，2–7 min 60% B，7–8 min 60%–40% B，8–15 min 40% B，15–20 min 40%–95% B，20–25 min 95% B。柱温45°C，进样体积3 μL。电离采用电喷雾电离（ESI），参数设置如下：m/z 50–2000，正负离子扫描模式，吹扫气流速10 arb，辅助气流速5 arb，鞘气流速35 arb，喷雾电压-3.0 kV，毛细管温度275°C，毛细管电压-30.0 V，管透镜电压30 V，H-ESI源加热器温度300°C。
2.3 校准标准品与质控样品的制备
芍药苷储备液通过将标准品溶于乙醇配制，浓度为48.0538 mg/mL（100 mM）。芍药内酯苷储备液通过称取1 mg样品，溶于乙醇至终浓度1 mg/mL。
2.4 植物材料制备与提取
白芍用咖啡研磨机粉碎。所得粉末使用CEM Mars XPress实验室微波进行提取，12.0771 g粉末用108 mL甲醇，按以下程序提取：60°C，400 MW（升温5 min，恒温加热10 min，冷却5 min）。提取后，液相小心倾析并使用Millipore系统与Durapore滤膜（孔径0.22 μm）过滤。粉末总共用新鲜甲醇提取四次。溶剂减压蒸干，得到1.4082 g提取物。
取0.025 mg所得提取物用于LC-MS测量，溶于1 mL甲醇。样品总共测量三次。
2.5 方法验证
2.5.1 选择性
通过比较乙醇空白和加标芍药内酯苷、芍药苷样品的色谱图来证明方法的选择性。将样品与最低校准标准品的色谱图进行积分和比较。
2.5.2 检测限与定量限
在乙醇中制备七个浓度水平（0.001, 0.002, 0.003, 0.005, 0.010, 0.025, 和 0.050 mg/mL）的校准曲线，并测量五次以评估方法的线性。检测限（LOD）和定量限（LOQ）根据校准曲线方程确定。
2.5.3 精密度与准确度
通过制备不同浓度的芍药内酯苷和芍药内酯苷样品（见表1）并各测量五次来评估精密度和准确度。将测得的浓度与预期浓度进行比较。
在负离子扫描模式下，芍药内酯苷的回收率为97.02%至125.83%，芍药苷为95.09%至109.48%。除样品1中芍药内酯苷浓度（+25.83%）因低于LOQ而超出可接受范围外，其余均在±15%限度内。精密度总体令人满意，%RSD大多<15%。正离子扫描模式下，回收率波动较大（芍药内酯苷84.73%–99.30%，芍药苷83.49%–128.74%），精密度在低浓度样品中较差。总体而言，负离子扫描模式在测试浓度范围内提供了更优的准确度和精密度。
2.6 NMR分析
为进行核磁共振（NMR）分析，制备了两个含有约4.5 mg芍药内酯苷标准品的样品，分别溶于约0.7 mL DMSO-d6和MeOD-d4。测量在500 MHz仪器上进行。在加入1和10 μL甲酸后重复测量。
2.7 软件
LC-MS测量使用XCalibur进行处理。图表使用Origin Pro 2025制备。NMR谱图使用TopSpin分析。
结果与讨论
3.1 方法开发
3.1.1 含甲酸的分析方法
最初使用含0.1%甲酸的甲醇和水作为流动相的方法，分别测量0.1 mg/mL的两种分析物标准品以及各0.05 mg/mL的混合物。芍药苷色谱图显示在6.80 min处有单一峰；而芍药内酯苷色谱图显示两个峰，一个主峰在6.39 min，一个较宽且强度较低的次级峰在9.44 min。两个峰的质谱图几乎相同。
3.1.2 使用10 mM醋酸铵-醋酸（pH 4.4）的分析方法
测试了不同参数（如色谱柱材料、柱温、流动相组成和梯度）对芍药内酯苷色谱图的影响。发现在两种不同色谱柱上以及使用添加0.1%甲酸的乙腈-水梯度洗脱后，第二个峰仍然存在。使用含0.1%甲酸的甲醇-水等度洗脱也显示芍药内酯苷有第二个峰。此外，较低的柱温（40°C, 35°C, 30°C）对第二个峰也无影响。
由于使用含10 mM醋酸铵和醋酸（pH 4.4）的流动相时，芍药内酯苷标准品的色谱图中未观察到第二个信号，因此开发了使用此流动相的方法。使用该方法测量的各0.05 mg/mL芍药内酯苷和芍药苷混合物的色谱图显示，芍药内酯苷的保留时间仅从6.39 min微移至6.32 min，而芍药苷的保留时间则从6.80 min较强地移至6.70 min。
3.2 方法验证
3.2.1 选择性
根据ICH M10指南，通过处理五个空白（乙醇）样品和最低校准样品（含两种物质，浓度0.001 mg/mL）的色谱图来确定选择性。即使在最低测试浓度下，标准品也能被检测到，而乙醇空白中未发现信号，表明方法具有足够的选择性。
3.2.2 检测限与定量限
制备芍药内酯苷和芍药苷的校准标准品，并进行五次重复进样分析。测得的检测限（LOD）和定量限（LOQ）见表2。
尽管正离子扫描模式下信号强度通常更高，但分析物的LOD和LOQ值在负离子扫描模式下 consistently 更低。这归因于正离子模式下背景噪声增加或可能的基质诱导离子抑制，降低了信噪比（S/N），损害了检测限。总体而言，负离子扫描模式表现出更好的灵敏度，更适合芍药内酯苷和芍药苷的定量分析。
3.2.3 精密度与准确度
根据表1中的标称浓度配制不同浓度的芍药内酯苷和芍药苷样品。结果总结在表3中。
负离子扫描模式下，回收率在可接受范围内，精密度良好。正离子扫描模式下，回收率波动较大，在低浓度下精密度超出可接受范围。总体而言，负离子扫描模式优于正离子扫描模式。
3.3 白芍提取物中芍药内酯苷和芍药苷浓度的测定
将所开发的方法应用于定量分析白芍甲醇微波提取物中的芍药内酯苷和芍药苷。由于验证过程中负离子扫描模式表现出更好的选择性和准确度，仅报告此模式下的结果。结果见表4。
测得的芍药内酯苷浓度高于LOD但低于LOQ，仅能进行半定量评估。芍药苷的测量浓度高于LOQ，可以进行可靠定量。
根据测得的浓度（0.025 mg提取物溶于1 mL乙醇），计算得到总提取物（1.4082 g）中芍药内酯苷和芍药苷的含量分别为64.81 ± 3.04 mg/gextract 和242.61 ± 13.53 mg/gextract 。这相当于白芍粗粉中分别含有7.56 ± 0.35 mg/gpowder 芍药内酯苷和28.29 ± 1.58 mg/gpowder 芍药苷。这些结果与文献报道的白芍中芍药内酯苷和芍药苷含量一致，证实了方法的可靠性及其在植物化学分析中的适用性。
3.4 NMR分析
为研究酸对芍药内酯苷标准品的影响，将样品溶于氘代二甲基亚砜和氘代甲醇，并在加入甲酸前后进行测量。1 H和13 C NMR谱图显示，即使在加酸前，也存在两种物质。通过与文献对比，可以清楚地将主要物质的信号识别为芍药内酯苷。第二种物质的信号强度要低得多，子物种与主物种的比例约为1:10。
加酸前后的NMR谱图在主物种方面没有显示任何差异。属于第二种物质的信号似乎显示出差异，但其含量仅为痕量，不足以在13 C或2D-NMR中进行研究。
结论
本研究开发并验证了一种用于同步定量芍药内酯苷和芍药苷的LC-MS方法。在方法开发过程中，在不同色谱柱和洗脱液系统中均观察到芍药内酯苷色谱图中存在一个次要小峰。研究表明，添加0.1%甲酸可能是产生第二个峰的原因。在切换到不含酸的洗脱液系统后，未再检测到该小峰。
进行了广泛的NMR研究以探究小峰的形成机制，但这些研究尚无定论。未出现额外的强峰或峰位移表明该机制可能不涉及异构化或显著的构象变化。
所开发的方法采用甲醇和含10 mM醋酸铵（用醋酸缓冲至pH 4.4）的水进行梯度洗脱。方法验证表明其具有足够的灵敏度、精密度和准确度。尽管信号强度较低，但负离子化模式因更低的LOD和LOQ以及在测试浓度范围内更好的准确度而更优。
此外，该方法应用于白芍提取物，得到芍药内酯苷含量为7.56 ± 0.35 mg/gpowder （半定量），芍药苷含量为28.29 ± 1.58 mg/gpowder （定量），与文献值一致。
未来，该方法或可适用于更复杂的基质（如细胞培养基）。初步的空白实验表明无显著的基质干扰。然而，对于定量而言，由于潜在的基质效应或可能的离子抑制（尤其在正离子扫描模式下），该方法需要进一步验证。
总体而言，所开发的方法适用于草药提取物中芍药内酯苷和芍药苷的同步定量，并可能适用于更复杂的基质（如细胞培养基）中的应用，但需要额外的验证以确保在此类条件下的灵敏度和重现性。
打赏
