核磁共振硬件用于活体代谢组学
实现活体代谢组学研究，除了标准的核磁共振硬件结合适当的样品制备技术外，一些特殊的硬件平台能根据样品或研究设计的特定需求提供额外优势。
高分辨魔角旋转核磁共振
高分辨魔角旋转（HR-MAS）NMR已成为活体代谢组学的强大分析工具，特别适用于组织等半固态生物样品的研究。其基本原理是使样品相对于静磁场（B0）以魔角（54.74°）高速旋转，从而平均掉由化学位移各向异性（CSA）和偶极耦合（DC）引起的、在固态或半固态样品中存在的取向依赖性共振频率分散，有效减小谱线展宽，提高谱图分辨率。HR-MAS NMR的一个关键优势在于能够在不进行提取的情况下分析半固态生物样品，从而获得比传统提取方法更接近体内状态的代谢谱图。该技术已成功应用于从微生物到哺乳动物模型等多种生物体系，包括细胞器（如分离的线粒体）、单细胞生物（如酵母、细菌）、细胞（如悬浮细胞、贴壁细胞）、组织乃至完整的模式生物（如秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼）。
尽管应用广泛，HR-MAS NMR在活体应用中也存在技术局限。高速旋转产生的机械应力是主要挑战，可能对脆弱样品造成细胞裂解。为在保持谱图质量的同时维护样品完整性，研究人员优化了旋转参数，例如采用超慢速MAS（约50 Hz）和降低转速（300–2500 Hz）的方案。此外，针对小样品体积的困难，也通过线圈设计和样品架的调整得以解决，例如高分辨魔角线圈旋转（HR-MACS）μNMR将质量灵敏度提高了多达17倍。
动态核极化
低灵敏度一直是活体代谢组学应用的主要瓶颈。动态核极化（DNP）技术通过将顺磁自由基的电子极化在低温和强磁场下转移至原子核，可将NMR灵敏度提高高达10,000倍，使纳摩尔至低微摩尔浓度的代谢物检测成为可能，从而能够观察细胞内快速的代谢过程。DNP在活体代谢组学中已成为一种独特工具，为活细胞和生物体内的代谢动力学提供了宝贵的见解。
在微生物如活酵母研究中，同位素富集的底物（如[2-13C]-丙酮酸）被用作超极化示踪剂，使其在细胞内摄取后，通过糖酵解或糖异生等途径生成NMR可检测的产物（如2,3-丁二醇），从而研究中间体和通量。在哺乳动物系统，特别是癌症研究中，超极化13C NMR已被广泛用于量化丙酮酸向乳酸转化的速率，这是瓦博格效应（Warburg effect）的标志性快速反应。研究表明，丙酮酸到乳酸的转化速率反映了肿瘤的恶性程度、代谢重编程及其周围的营养微环境。
尽管DNP具有独特优点，但其应用也存在固有缺点。超极化信号会按照其T1弛豫时间衰减，限制了可观测时间仅为数秒至数分钟。改进的极化剂（如Fremy's salt）的开发，通过便于自由基去除和减少自由基诱导的弛豫，提供了部分解决方案。此外，还有成本高昂的极化硬件、样品传输需求以及复杂的技术专长等实际考虑因素，目前限制了其广泛实施。
芯片与探针
微流控芯片技术与NMR光谱学的结合，缓解了传统上限制活体代谢组学应用的体积和灵敏度限制。通过微型化样品处理和检测系统，微流控-NMR平台在实现对细胞代谢进行环境控制和实时监测的同时，增强了质量灵敏度（指每单位质量的灵敏度）。因此，微流控-NMR非常适用于质量有限的样品或小体系，如单细胞或类器官。
微流控-NMR硬件的关键方面包括检测器设计和保持活体标本生物相容性的微型化技术。例如，平面波导微槽NMR检测器能够观察活肿瘤球体长达24小时；优化的带状线线圈克服了传统系统的空间限制。样品体积需求的减少也促进了该技术的应用，超紧凑单芯片探针可检测低至0.1 nL样品体积中的代谢物。
与微流控集成主要解决活体样品的微型化和环境控制不同，低温探针技术的近期进展集中于最大化灵敏度。低温探针通过冷却射频线圈和前置放大器来降低热噪声，相对于室温探针可提供数倍的信噪比增益。这些增益转化为更短的采集时间或使用标准5 mm样品管时所需更小的样品体积（如果结合Shigemi管和磁化率匹配插入件使用）。低温检测的使用在与各种样品类型（包括细胞器、线粒体、细胞、秀丽隐杆线虫和离体脑组织）的活体NMR代谢组学中已变得流行。
样品支持系统
本节讨论用于在NMR管中进行活体代谢组学研究时，支持样品活性或稳定性的硬件或技术，确保样品在检测线圈区域内保持存活和代谢活性。
灌注系统
与NMR联用的灌注系统已被证明能有效在更接近生理条件下长时间实时监测代谢。这些系统持续供应新鲜培养基和氧气，同时清除代谢副产物。灌注系统主要由两部分组成：调节培养基循环的基于硬件的流控系统，以及在允许分子交换的同时将样品固定在检测线圈区域内的固定化基质。流控系统包括将培养基储液器连接到NMR管的泵和管路。虽然注射泵在蛋白质结构研究中很流行，但蠕动泵或液相色谱泵在代谢研究中占主导地位。精确的流速控制是关键因素，必须针对每个特定的生物体系和固定化基质进行调整。低流速（约50–100 μL/min）用于脆弱样品（如水蚤）或包裹在温和支持基质（如低熔点琼脂糖）中的哺乳动物细胞，以提供最小应激条件和有效的代谢物交换。较高的流速（约3 mL/min）则用于密集的固定化系统（如微载体珠），以对抗细胞的重力作用。
连续循环系统
与灌注系统将培养基直接持续供应到NMR管不同，连续循环平台采用不同策略：将生物样品维持在外部生物反应器中，并循环至NMR检测区域进行分析。通过将生长环境与检测硬件分离，该方法允许更大的培养体积和更长的研究时间，而无空间限制，同时更容易控制pH、氧水平和营养浓度等环境参数。因此，该方法有两个关键优势：用于灵敏代谢通路检测的可扩展性和精确的环境控制。可扩展性已在将L-阿拉伯糖代谢与酵母物种（如Candida arabinofermentans）中磷酸戊糖途径（PPP）的氧化分支联系起来的研究中得到证明，其中大量的培养体积（50 mL）有助于进行详细的通路分析。精确的实验控制已在细菌系统（如乳酸乳球菌）中得到利用，研究了在不同条件下（有氧/无氧）、在缺乏乳酸脱氢酶的菌株中葡萄糖和甘露醇代谢。与灌注系统相比，连续循环系统更适合悬浮培养物或单细胞生物，因为循环可能会破坏贴壁细胞的附着。
样品支持技术
微载体珠是早期用于在NMR管内培养贴壁依赖细胞的固体支持方法之一，尤其与灌注系统联用。由葡聚糖、纤维素和聚苯乙烯等生物相容性材料制成的这些球形支持物（直径160–300 μm）提供可定制的表面特性，适用于各种细胞类型。其刚性结构支持高细胞密度培养，同时最大限度地减少NMR采集期间细胞运动引起的信号损失。该方法已证明适用于需要稳定细胞群体的长期代谢研究。
低熔点琼脂糖已成为NMR活体代谢组学研究中使用更广泛的细胞支持基质。通过羟乙基化修饰，其凝胶温度降至26–30°C，允许在生理安全、无损伤的温度下温和地封装细胞。该方法将细胞三维固定分布在NMR管内，在实验期间提供稳定性。常见方法是使用0.8% (w/v) 的线状琼脂糖，它在机械稳定性和营养扩散之间取得平衡。尽管广泛用于贴壁和悬浮细胞，但低熔点琼脂糖基质内缺乏粘附位点，因此贴壁细胞以悬浮状态维持，这可能不是某些实验目的的最佳方法。
支持细胞附着的凝胶基质，如Matrigel、Mebiol凝胶和胶原蛋白，为贴壁细胞提供更生理相关的微环境。这些基质含有细胞外基质（ECM）蛋白（如层粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白），并可补充生长因子（EGF, IGF-1, bFGF, TGF-β），支持细胞附着并促进细胞增殖和分化。例如，Mebiol凝胶已被用于研究细胞内能量代谢和氧化还原稳态，其提供稳定代谢环境的能力值得称赞。其多功能性还允许实验后回收细胞以进行后续细胞分析。
海藻酸盐胶囊已在3D细胞培养领域开发并适用于细胞内NMR蛋白质结构研究。这种多糖无毒、生物相容性好，并能通过与二价阳离子（通常是Ca2+）交联形成稳定的凝胶。虽然纯海藻酸盐不支持细胞粘附，但精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽或聚赖氨酸修饰的海藻酸盐可以促进贴壁细胞的附着。有几种方法可以实现均匀的胶囊生产和重现性。最简单的方法是挤出滴注技术，使用1–4%的海藻酸盐溶液和针头生成直径超过1500 μm的珠子。其他方法包括同轴流动法和静电电位法。对于活体NMR，基于离心的方法提供了一种更快、更简单的珠子生成方法。海藻酸盐的一个优点是可以使用柠檬酸盐溶解，以便实验后回收细胞。
悬浮方法与样品管 对于一些可以在几分钟或约2小时内监测的代谢途径（如糖酵解约1分钟，TCA循环在1-2小时内），简单的悬浮设置可能就足够了，可以避免使用可能影响实验重现性或限制更广泛应用的复杂硬件或专用样品支持系统。简单的样品悬浮（无支持系统）已用于从细胞器到复杂组织的广泛生物系统。对于这些，使用了各种样品管配置来优化样品体积、细胞活力和信号灵敏度之间的平衡。虽然早期研究使用10 mm管，但现在标准5 mm管变得更流行。当样品体积有限或需要高质量灵敏度时，可以使用更小直径的样品管（如3 mm或1.7 mm）。Shigemi管（5 mm格式，250 μL）也很流行，因为它们允许更小的样品体积，同时由于底部具有磁化率匹配的玻璃部分而保持整体灵敏度。另一种磁化率匹配方法是D2O匹配的Doty塞，可与标准NMR管一起使用。
用于活体NMR代谢组学的NMR脉冲技术
先进NMR脉冲技术的应用有助于解决活体代谢组学的固有挑战，例如样品异质性导致的谱线展宽和重叠的代谢物信号。虽然上述硬件方法显著提高了谱图分辨率和灵敏度，但基于脉冲的方法提供了补充策略来增强谱图分辨率、选择性检测目标代谢物并提高活体代谢组学数据的可解释性。
一个基本考虑是确定感兴趣生物系统是否与稳定同位素标记兼容。同位素标记可以提供更好的背景信号对比度，通过多维NMR提高分辨率，在脉冲序列设计中提供灵活性，并提高异核实验的灵敏度。对于同位素标记的样品，一个明显的选择是二维间接实验，如异核单量子相干（HSQC），因为它具有高灵敏度并由第二维提供增强的实际分辨率。HSQC是一种广泛应用的、非靶向的代謝谱分析工具，适用于各种系统。
除了通用的代謝谱分析外，同位素标记还可用于使用定制的脉冲技术选择性检测代谢物。例如，最初为均匀标记蛋白质开发的HNCO脉冲序列已被重新用于实时追踪标记的谷氨酰胺。谷氨酰胺的H–15N-13CO自旋系统可以通过HNCO脉冲序列选择，产生无背景的谷氨酰胺酰胺信号。类似地，蛋白质技术的适应性也被应用。
当同位素标记不可行时，已使用替代方法来解决谱线展宽和谱图重叠问题。相位校正高分辨离魔角转向（PHORMAT）通过抑制即使在低转速下的边带，提供了一种替代方案。另一种策略是解决磁化率差异。这方面的重大进展源于利用溶质和溶剂自旋之间多量子相干的技术的发展。这些方法，称为分子间单量子或多量子相干（iSQC或iMQC），随着时间的推移不断改进，并已应用于各种不均匀样品，产生尖锐的共振。
解决谱图重叠的另一个策略是仅检测具有特定性质的代谢物。一种这样的方法是单重态过滤NMR，它选择性检测长寿命的单重态，而其他信号衰减。另一种选择性检测技术是DREAMTIME。该方法对J耦合自旋采用多个双选择性激发脉冲和双量子滤波，能够选择性观察感兴趣的代谢物，即使它们的信号被埋藏在重叠峰内。除了减轻谱线宽度和重叠之外，局部化NMR光谱通过将激发/检测限制在定义的切片或体素内而不需要物理切片，解决了异质组织中部分体积平均化的问题。
用于活体代谢组学的生物系统
前述部分讨论的技术和硬件已应用于各种活体生物系统。下面按生物复杂性递增的顺序进行概述。
细胞器（线粒体、细胞核）
线粒体是细胞中最基本的代謝功能机器。从技术上讲，分离的细胞器（如线粒体）不是“活”生物体，但它们是独立的功能单元，并且一直是NMR实时代谢监测的有效目标系统。活体NMR线粒体研究早在1990年代初期就已开展，使用从各种来源（如大鼠心脏、牛肾上腺皮质）分离的线粒体。研究人员研究了各种代谢过程，包括克雷布斯循环、布洛芬代谢和苹果酸代谢。13C富集底物（如丙酮酸、苹果酸）的使用增强了13C NMR光谱的灵敏度，使得能够监测线粒体内的代谢反应。随后的研究使用HR-MAS NMR研究了大鼠心脏线粒体中线粒体功能障碍的代谢异常和生物标志物。克服这些一维方法的灵敏度和分辨率问题，一个重大进展是使用质子检测的二维NMR与13C标记的示踪剂。该技术确定了乙酰磷酸作为哺乳动物线粒体中的关键代谢中间体。
除了线粒体，活体代谢组学也应用于细胞核。最近一项对分离细胞核的活体代谢组学研究表明，乳酸可能作为组蛋白乙酰化的直接表观遗传碳源在细胞核内发挥作用。
简单低等生物和细胞（细菌、酵母、细胞、藻类）
在下一个生物复杂性层次上是低等生物，主要是单细胞生物，NMR已有效应用于这些系统。细菌已使用生物反应器进行探索，能够利用同位素标记的底物在生物体水平进行监测。细菌代谢也使用HR-MAS NMR进行了研究。除了细菌，NMR还为真核生物（如酵母、微藻、真菌和哺乳动物细胞）的代谢过程提供了宝贵的见解。在酵母研究中，用[U–13C]葡萄糖等同位素标记酿酒酵母，使得能够使用DNP NMR等先进技术实时了解中心碳代谢。微藻和真菌代谢也使用类似的NMR方法进行了研究。哺乳动物细胞代谢经常与涉及生物反应器的灌注系统以及固定化基质一起研究，特别是当需要长时间监测时。哺乳动物癌症代谢的研究，特别是糖酵解的最后一步，受益于DNP技术。
组织（动物、植物）
虽然上述实时研究在细胞水平提供了有价值的代谢见解，但对完整组织的研究提供了关于组织特异性代谢变化或更高级生物系统中代谢特征的信息。在癌症研究中，使用HR-MAS NMR进行肿瘤组织分析能够鉴定完整胶质母细胞瘤活检样本中的代谢物，有助于更精确地分类原发性和继发性脑肿瘤。活体NMR代谢组学也已应用于植物组织，突出了其在研究不同生物系统方面的多功能性。早期的例子包括1975年使用13C NMR分析完整的大豆胚珠，为无损代谢物分析奠定了基础。
多细胞生物（动物）
随着活体NMR领域的发展，该技术被应用于更复杂的生物系统，包括整个生物体，如水蚤、果蝇、秀丽隐杆线虫和斑马鱼等脊椎动物。这允许在生物体水平进行体内研究，将细胞水平的见解与生物体生理学联系起来，从而增强其在生物医学应用中的效用。水蚤是一种小型淡水甲壳动物，常被用作生态毒理学和环境研究中的模式生物。由于其身体透明且体积小，水蚤已成为体内NMR研究和内部过程无创观察的良好模型。果蝇是遗传学、衰老和神经生物学中广泛使用的模式生物。秀丽隐杆线虫由于其体积小、基因组已测序和强大的遗传工具，非常适合活体NMR研究。斑马鱼已广泛用于生物学研究。虽然成年鱼太大，但其胚胎已用于标准或HR-MAS NMR设置中。
生物体间系统
生物学中一个新兴领域是宿主-肠道微生物组相互作用的研究。尽管兴趣广泛，但由于传统啮齿动物模型的高成本和技术复杂性，该领域仍然具有挑战性。最近，秀丽隐杆线虫作为一种有前景的替代方案受到关注，它提供了与细菌物种一起的实验便利性。此外，其与活体NMR方法的兼容性使其成为NMR研究人员研究生物体间代谢相互作用的有吸引力的模型。一项研究使用19F NMR监测活秀丽隐杆线虫-大肠杆菌共生系统中5-氟尿嘧啶（5-FU）的实时代谢，揭示了药物代谢中细菌亚种特异性差异。另一个例子使用实时异核2D NMR研究了秀丽隐杆线虫-粪肠球菌系统中的左旋多巴代谢。微生物多巴胺产生的差异与宿主中α-突触核蛋白聚集和行为表型相关，为了解帕金森病的关键病理特征提供了见解。
