红酵母利用农业副产物与废弃食用油高效合成稀有类胡萝卜素和微生物油脂的可持续生物工艺研究

本研究针对化学合成类胡萝卜素的环境负担及天然来源提取效率低的问题，开发了利用豆渣(soy okara)和废弃食用油等农业食品残渣的红酵母发酵工艺。研究筛选出Rhodotorula paludigena CBS 6565和Rhodotorula diobovata CBS 324两株高产菌，通过酶解预处理优化和补料分批发酵，实现了262.4 mg/L类胡萝卜素（其中β-胡萝卜素140 mg/L，圆红素torularhodin 72.5 mg/L）与18 g/L微生物油脂（占细胞干重56%）的高效联产，为农业废弃物的高值化利用提供了创新方案。

在追求可持续发展的今天，如何将丰富的农业副产物转化为高附加值产品成为生物技术领域的热点课题。类胡萝卜素作为天然色素和抗氧化剂，在全球市场的规模预计到2030年将达到21亿美元，其需求正以每年约3.5%的速度增长。然而，当前市场上80%-90%的类胡萝卜素仍通过化学合成获得，这不仅与全球"绿色消费"趋势相悖，其过程也可能带来环境压力。虽然植物提取是天然类胡萝卜素的重要来源，但存在提取效率低、受季节和地理限制等问题。因此，开发微生物发酵法生产类胡萝卜素，特别是利用废弃生物质作为培养基，成为符合循环经济理念的理想解决方案。

在众多微生物中，一类被称为"红酵母"的菌株（如Rhodotorula、Rhodosporidium等）表现出独特优势：它们不仅能合成β-胡萝卜素、圆红素(torularhodin)和圆酵母素(torulene)等多种类胡萝卜素，还属于产油微生物，能够积累大量油脂（最高可达细胞干重的70%）。这些类胡萝卜素储存在脂质体中，受到保护而免于光氧降解，而酵母油脂的脂肪酸组成与植物油相似，适合食品应用。更为重要的是，红酵母能够利用多种碳源，包括工农业废弃物，这为低成本生产提供了可能。

发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上的这项研究，旨在探索红酵母利用农业食品残渣生产稀有类胡萝卜素和微生物油脂的潜力。研究人员重点关注如何通过优化发酵条件和培养基组成，提高类胡萝卜素和油脂的产率，同时降低生产成本，实现废弃物的高值化利用。

研究采用的关键技术方法包括：红酵母菌株筛选（从10株红酵母中筛选出高产菌株）、酶解预处理优化（使用商业酶制剂Cellic CTec2水解豆渣释放可发酵糖）、发酵工艺优化（比较尿素和硫酸铵作为氮源的效果，并在2升生物反应器中实施补料分批发酵策略，添加废弃食用油和蜜饯水果加工糖浆作为补充碳源）。分析技术涉及高效液相色谱(HPLC)定量类胡萝卜素、磺化磷钒法(SPV)测定脂质含量，以及酶法测定糖含量和凯氏定氮法测定氮含量。

菌株筛选与类胡萝卜素提取优化

研究人员首先对10株红酵母菌株在YPD培养基中进行筛选，评估其产生β-胡萝卜素、圆红素和圆酵母素的能力。结果显示，不同菌株的类胡萝卜素组成存在显著差异。Rhodotorula paludigena CBS 6565是β-胡萝卜素（4.6 mg/gDW）和圆酵母素（4.0 mg/gDW）的最佳生产者，而Rhodotorula diobovata CBS 324则主要积累圆红素（3.5 mg/gDW，占总类胡萝卜素的56%）。基于这些结果，选择这两株菌进行后续研究。

在提取方法上，研究发现珠磨破碎法（使用玻璃珠在珠磨仪中进行）比单纯溶剂提取更有效，能实现更高的色素回收率，且可通过自动化操作避免色素降解。

混合碳源与氮源对类胡萝卜素和脂质生产的影响

为模拟木质纤维素水解物的碳源组成，研究使用葡萄糖和木糖按2:1比例作为混合碳源，并比较了尿素和硫酸铵作为氮源的效果。在高碳氮比(C/N=75)条件下，R. paludigena CBS 6565使用硫酸铵时生物量更高（14.5 g/L vs 12.0 g/L），但使用尿素时类胡萝卜素产量更高（87 mg/L vs 62 mg/L），尤其是β-胡萝卜素（65 mg/L vs 37 mg/L）。脂质含量在两种氮源下均约为细胞干重的50%，但因生物量差异，硫酸铵条件下的总脂产量更高。

R. diobovata CBS 324对木糖利用效率低，脂质积累较少（<35%干重），但在尿素存在下类胡萝卜素产量显著提高（78 mg/L vs 25 mg/L），且以圆红素为主。结果表明，尿素作为低成本氮源，能有效促进类胡萝卜素合成。

豆渣酶解预处理及其作为发酵培养基的评估

豆渣是大豆加工副产物，富含碳水化合物、蛋白质等营养成分。研究通过酶解预处理优化可发酵糖的释放，发现使用10μL/mL的Cellic CTec2酶制剂效果最佳，释放出18.7 g/L葡萄糖。添加淀粉酶并未显著增加糖产量。豆渣水解物本身含有1-1.2 g/L有机氮，碳氮比低于20，适合酵母生长。

在豆渣培养基中培养48小时后，两株菌的生物量均高于YPD培养基，但葡萄糖几乎耗尽。补充蜜饯水果加工糖浆（含199 g/L葡萄糖和296 g/L果糖）后，生物量和产物继续积累。72小时后，R. paludigena CBS 6565的β-胡萝卜素产量最高（43.5 mg/L），而R. diobovata CBS 324的圆红素产量达77 mg/L。脂质产量分别为10 g/L（R. paludigena，占干重41.1%）和14 g/L（R. diobovata，占干重38.8%）。

生物反应器规模的过程强化：添加废弃食用油提高产量

在2升生物反应器中，对最佳生产者R. paludigena CBS 6565进行放大培养。豆渣酶解在生物反应器中进行24小时，接种前添加酵母提取物（1 g/L）和1%废弃食用油以提高乙酰辅酶A(acetyl-CoA)利用率。通过搅拌控制（400-800 rpm）维持溶氧高于30%，46小时时补充芒果加工糖浆。

与摇瓶培养相比，生物反应器中的生物量和类胡萝卜素产量均增加。72小时时总类胡萝卜素达189.3 mg/L（6.8 mg/gDW）；95小时时进一步提高至262.4 mg/L（9 mg/gDW），其中β-胡萝卜素和圆红素分别达140 mg/L和72.5 mg/L，而圆酵母素下降。脂质产量为18 g/L，占细胞干重56.2%。

研究结论表明，Rhodotorula paludigena CBS 6565和Rhodotorula diobovata CBS 324在利用农业副产物生产类胡萝卜素和微生物油脂方面具有巨大潜力。通过优化豆渣酶解工艺、使用尿素作为氮源、结合废弃食用油和果业副产糖浆的补料分批策略，实现了高效共生产。在生物反应器规模下，R. paludigena CBS 6565达到了262.4 mg/L的总类胡萝卜素和18 g/L的脂质产量。

这一研究的重要意义在于开发了一种将低价值农业废弃物转化为高价值产品的集成工艺，符合循环生物经济原则。豆渣和废弃食用油的利用不仅降低了生产成本，也为废弃物管理提供了解决方案。产生的类胡萝卜素-油脂复合产品具有多种潜在应用，如功能性食品、饲料添加剂等。特别是圆红素的高产量值得关注，这是一种具有强抗氧化活性且尚未商业化的稀有类胡萝卜素，其羧基结构增强了水溶性，适合作为水性饲料添加剂。研究证实了红酵母在可持续生物制造中的价值，为工业化生产高价值天然产物提供了技术基础。