结核病至今仍是全球最致命的传染病之一，其致病元凶结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）在人体内能够长期潜伏、持久存活的关键，在于它能够在宿主体内形成一种特殊的结构——肉芽肿（Granuloma）。这种由免疫细胞聚集而成的“堡垒”，原本是宿主用来困住和消灭细菌的防御工事，但狡猾的结核分枝杆菌却反过来利用肉芽肿作为其生存和繁殖的温床。尤其是在肉芽肿的坏死核心（necrotic core）区域，细菌面临着缺氧、营养限制和氧化应激等多重严峻挑战，却依然能够顽强存活，这背后的分子机制一直是科学家们努力破解的谜题。传统的实验模型，如小鼠，往往不能完全模拟人类结核肉芽肿的关键特征，如中央坏死和巨噬细胞的上皮样转化，这限制了对肉芽肿微环境中宿主与病原体复杂互作的深入理解。
为了攻克这一难题，研究人员将目光投向了成年斑马鱼-海分枝杆菌（M. marinum）感染模型。该模型能形成与人类结核病高度相似的坏死性肉芽肿。发表在《科学·进展》（SCIENCE ADVANCES）上的这项研究，巧妙地结合了高分辨率活体成像、肉芽肿外植体培养（Myc-GEM）、药理学和遗传学干预以及创新的双RNA测序（dual RNA-seq）技术，首次在坏死性肉芽肿这一关键微环境中，同时绘制了宿主免疫细胞和病原体的全基因组转录图谱，揭示了由中性粒细胞（Neutrophils）和坏死区域共同驱动的复合转录程序，为理解结核病的慢性感染机制开辟了新视角。
研究人员主要运用了几项关键技术：利用成年斑马鱼海分枝杆菌感染模型及其肉芽肿外植体培养系统进行高分辨率动态成像；通过药理学抑制剂Duvelisib和中性粒细胞特异性表达显性负效应Rac2（Rac2D57N）的转基因斑马鱼进行功能干预；建立了一种基于oligo(dT)磁珠去除宿主poly(A) mRNA以富集细菌转录本的双RNA测序方法，对野生型和中性粒细胞功能缺陷型肉芽肿进行转录组分析；对肉芽肿内的中性粒细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）以解析其异质性；并利用杂交链式反应RNA荧光原位杂交（HCR RNA-FISH）进行空间验证；最后对临床结核分枝杆菌菌株进行了基因组进化分析。
研究结果
肉芽肿微环境与中性粒细胞形态和功能相关
研究人员首先利用肉芽肿外植体模型，根据细菌分布模式将肉芽肿分为两种类型：I型肉芽肿中细菌主要局限于坏死核心，II型肉芽肿中细菌在坏死核心外的区域（ENR）也有分布。他们发现，中性粒细胞的形态、运动能力和存活时间因所处的肉芽肿类型和区域而异。在I型肉芽肿和II型肉芽肿的坏死核心附近，中性粒细胞呈细长形，运动活跃，可巡逻整个肉芽肿；而在II型肉芽肿的ENR区域，中性粒细胞多为圆形，运动迟缓，且快速发生裂解死亡。这表明肉芽肿内存在不同的微环境，深刻影响着中性粒细胞的行为和命运。
单细胞RNA测序分析鉴定肉芽肿中性粒细胞的转录异质性
通过对肉芽肿中的中性粒细胞进行单细胞RNA测序分析，研究人员将其分为三个亚群。Group 0中性粒细胞高表达主要组织相容性复合体（MHC）相关基因，提示其可能具有抗原呈递潜能。Group 1中性粒细胞富含与肌动蛋白细胞骨架动力学、细胞迁移和糖酵解相关的基因转录本，这与显微镜下观察到的运动活跃的细长形中性粒细胞特征相符。Group 2中性粒细胞则高表达粒细胞分化、促炎因子以及促凋亡相关基因，这与ENR区域快速死亡的圆形中性粒细胞表型一致。这些发现为中性粒细胞的功能异质性提供了转录水平的证据，并且在与非人灵长类及人类肉芽肿数据的对比中显示出一定的保守性。
中性粒细胞在坏死性肉芽肿中扮演病原体许可性角色
为了探究中性粒细胞的功能，研究人员使用PI3Kγ/δ抑制剂Duvelisib处理肉芽肿外植体，或利用转基因技术特异性抑制中性粒细胞的关键信号分子Rac2的功能。两种干预均导致肉芽肿内中性粒细胞变得圆润、运动能力下降，并显著降低了细菌负荷。这表明，功能正常的中性粒细胞在坏死性肉芽肿微环境中反而支持了分枝杆菌的生长，扮演了“帮凶”的角色。
肉芽肿双RNA测序策略解码中性粒细胞-分枝杆菌互作
为了克服肉芽肿总RNA中细菌转录本占比极低（仅0.1-0.25%）的技术瓶颈，研究团队开发了一种创新的双RNA测序策略：利用oligo(dT)磁珠选择性去除带poly(A)尾的宿主mRNA，从而将细菌mRNA的测序 reads 富集了4-9倍。这使得能够同时高质量地分析宿主和病原体的转录组，为揭示中性粒细胞如何影响肉芽肿内细菌的适应性提供了可能。
中性粒细胞通过诱导devR调节子促进细菌在肉芽肿中的存活
对细菌转录组的分析发现，在中性粒细胞功能缺陷（Rac2D57N）的肉芽肿中，分枝杆菌的双组分调控系统DevR-DevS及其下游的调节子（regulon）基因表达显著下调。DevR-DevS系统能被缺氧、一氧化氮（NO）等压力信号激活，对细菌在慢性感染中的持久存活至关重要。功能实验证实，devR基因突变株在野生型斑马鱼肉芽肿中的生长能力减弱；而过量表达devR-devS能部分挽救细菌在中性粒细胞缺陷肉芽肿中的生长缺陷。这表明中性粒细胞可能通过（直接或间接）诱导devR调节子，来促进细菌在肉芽肿环境中的适应和生存。
中性粒细胞缺陷调节炎症和增殖相关的转录特征
宿主转录组分析显示，中性粒细胞缺陷的肉芽肿中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）信号、干扰素-γ（IFN-γ）反应和氧化应激相关通路基因表达上调，而与E2F转录因子相关的细胞增殖信号通路基因下调。这提示中性粒细胞在调节肉芽肿内的免疫平衡和细胞增殖动态中发挥着重要作用。
双RNA测序揭示肉芽肿特异的细菌转录谱
通过比较肉芽肿内和体外培养的分枝杆菌转录组，研究人员鉴定出345个在肉芽肿中特异性上调的细菌基因（与小鼠巨噬细胞内感染数据不重叠）。这些基因涉及多个适应性的功能模块，包括：复苏促进因子（rpfA, rpfB, rpfE）、离子转运（如钾离子转运系统kdpABC、磷酸盐摄取pitA/B、镁离子摄取mgtC）、电子传递链（特别是适应缺氧环境的cydAB系统）、氮代谢、氧化应激反应以及分子伴侣和Clp蛋白酶等。这些模块反映了细菌在肉芽肿坏死核心这一独特微环境中面临的挑战（如生长停滞、离子限制、缺氧、应激）及其应对策略。对其中两个高表达基因（narK1和MMAR_4345，其同源基因为Rv1115）的突变株进行功能验证，发现它们在肉芽肿中的生存能力显著下降，证实了这些肉芽肿特异性基因对细菌持久感染的重要性。
坏死性肉芽肿中富集的转录本存在进化选择证据
最后，研究人员分析了来自不同谱系的69株临床结核分枝杆菌基因组，发现上述肉芽肿特异性诱导的细菌基因中，存在大量谱系特异性的非同义突变，且其频率显著高于随机突变预期。这表明这些在肉芽肿环境中发挥重要功能的基因，在结核分枝杆菌适应人类宿主的过程中经历了自然选择，是其进化成功的潜在靶点。
研究结论与意义
本研究通过多学科交叉的方法，深入揭示了坏死性结核肉芽肿这一关键生态位中宿主与病原体的复杂互作网络。它不仅证实了中性粒细胞在促进细菌生存中的“病原体许可性”作用，并首次将这种作用与细菌关键的DevR-DevS持久性调控通路联系起来。所开发的细菌转录本富集双RNA测序技术，为研究其他复杂感染微环境中的病原体适应性提供了强大工具。
更重要的是，该研究系统性地描绘了分枝杆菌在肉芽肿坏死核心这一独特细胞外环境中的全套适应性转录程序，鉴定出多个新的潜在功能模块和关键基因（如narK1, Rv1115同源基因）。这些发现不仅深化了对结核分枝杆菌持久感染机制的理解，也为开发新的治疗策略指明了方向：一方面，靶向中性粒细胞的有害功能（例如使用Duvelisib等已获批药物）可能作为宿主导向疗法（host-directed therapy, HDT）的辅助手段；另一方面，细菌在肉芽肿中特异性依赖的代谢通路和应激反应机制（如钾离子摄取、复苏促进因子等），可能成为缩短疗程、克服耐药性的新颖抗菌靶点。
最后，基因组进化分析表明，肉芽肿特异性基因是结核分枝杆菌在人类宿主中长期共进化的热点，凸显了这些基因在细菌成功定殖和传播中的核心地位。这项研究极大地丰富了我们对结核病发病机制的认识，为最终攻克这一古老传染病提供了重要的科学依据和新颖的干预思路。
