从F1-ATP酶分子马达的实验轨迹中恢复一个长期缺失的热力学极限

本研究通过实验轨迹和改进的统计方法验证了分子马达的热力学极限，解决了长期存在的步进比例争议，并简化了滞止力测量，为人工马达设计提供理论框架。

侯瑞正|Toyabe Shōichi|王志松

西安工业大学理学院应用物理系，中国陕西省西安市710048

摘要

在分子马达领域，一个通用的热力学极限在理论中被广泛使用，但在实验中却长期缺失。根据这一极限，马达的正向-反向步进比遵循一个与反作用力相关的明确的全步长缩放关系，并且进一步与热力学力相关，这可能通过低力实验甚至与力无关的光学跟踪实验来提供关于马达的停滞力和能效的信息。现在，这一极限直接从F₁-ATPase马达的实验轨迹中得到了验证——在一个严格的“双盲”测试中，通过改进的统计方法和基于Jarzynski等式的严格热力学分析，独立地从轨迹中提取了热力学力和步进比。因此，这项研究消除了分子马达领域长期存在的争议，并显著降低了停滞力测量的难度。值得注意的是，这项研究还使得实验上能够获取难以捉摸的步进比，该步进比本质上是循环通量的比率，迄今为止一直难以测量。最后，基于Jarzynski等式的热力学分析提供了一个全面的概念框架，用于分析生物分子马达的进化优化性，并指导高性能人工分子马达的开发。

引言

随机热力学有一个基本关系[1]，它将热力学驱动力与方向性循环动力学联系起来，类似于经典力学中控制力-运动关系的牛顿第二定律。即：$J_{\kappa +}/J_{\kappa -}=\exp \left(X_{\kappa }/k_{B}T\right)$其中X_κ表示在温度T的等温环境中的热力学力[1]（或循环亲和力[2]），J_κ+表示朝向正方向的稳态循环流量，J_κ-表示反向循环流量。这个关系量化了非零热力学力如何驱动循环流量偏离平衡（即J_κ+/J_κ- ≠ 1，因为X_κ ≠ 0）。这一关系基于质量作用定律[3]、[4]、[5]、详细平衡[6]或涨落定理[7]建立，并被认为对所有受驱动的分子系统都是普遍有效的，从基本化学反应[1]、[5]、分子马达[8]、[9]、[10]、[11]、[12]到复杂的随机网络[13]、[14]、[15]（涉及许多分子/反应）以及活性物质（例如肌肉）。然而，这一关系对于非线性化学反应网络的有效性直到最近才通过严格的理论检验[5]。对于分子马达领域来说，这一基本关系涉及一个重要的热力学极限，至今在分子马达的实验中一直缺失。根据方程1，如果马达在反作用力f的作用下进行大小为d的步进，那么马达的正向-反向步进比必须遵循以下关系：$P_f/P_b=\exp \left(\left(\Delta G_0–\mathrm{fd}\right)/k_B\right)。$

这里P_f和P_b分别表示马达在f作用下的正向和反向步进的概率，而P_f/P_b比率等于产生马达步进的化学机械循环的正向-反向流量比率（即对于化学驱动的马达，J_κ+/J_κ-）。对于负载依赖的流量比率（在f下的J_κ+/J_κ-），相应的热力学力是X_κ(f) = ΔG₀ – fd，即热力学力的零负载值（ΔG₀）减去马达对负载所做的机械功（fd）。零负载热力学力（ΔG₀）是每个消耗的燃料分子的化学势差（Δμ），对于效率约为100%的马达来说是这样的，但对于化学机械耦合不完美的马达来说则低于Δμ[16]、[17]。根据方程2，任何分子马达的步进比P_f/P_b必须随着反作用力f和马达的全步长d呈指数级缩放，因为产生了功（fd）。这种全步长缩放在分子马达理论[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[18]、[19]、[20]、[21]中被广泛使用，但在任何分子马达的单分子机械实验中从未观察到。这是因为这些实验实际上测量的是不是P_f/P_b比率（对应于循环流量），而是正向和反向位移的比率[22]、[23]，后者对应于全步进循环的个别转换。由于分子系统或网络的循环流量数量可能大于可测量的局部转换流量数量（因此无法从后者重建前者，正如T. L. Hill早期指出的[1]），因此测量这样的全局量是困难的。因此，尽管进行了数十年的单分子机械实验，许多生物分子马达以及最近的人工对应物[24]的全步长缩放仍然缺失。正向-反向步进比P_f/P_b是这些马达的一个重要性能指标，至今仍无法通过实验获得。步进比的缺失全步长缩放（方程2）是分子马达领域长期存在的争议。

步进比的热力学极限（方程2）在分子马达领域具有实际意义。方程2表明，在任何单一的f值下，所有的化学力都可以产生马达产生的最大力（也称为停滞力）。即在单一f值下的化学力X_κ(f)首先产生常见的零负载热力学力ΔG₀ = X_κ(f) + fd，然后在僵局条件下（P_f/P_b → 1且f → f_{s）根据方程2产生停滞力fs = ΔG0/d。按照常规做法，停滞力进一步表示马达的能效为η = Wmax/Δμ，其中最大功Wmax = fsd。因此，原则上可以从马达在任何低于其停滞力的单一反作用力下的操作中获得马达的停滞力和能效。目前，分子马达的停滞力是通过复杂的单分子机械实验[16]、[22]、[24]、[25]、[26]使用光学/磁镊子或原子力显微镜来测量的，在这些实验中，对单个马达施加反作用力并记录其承载负载的操作轨迹。许多重复实验的轨迹提供了依赖于力的速度或方向信号，这些信号逐渐趋近于零，从而接近马达的停滞力。这种停滞力的渐近确定需要在多个接近僵局的力值下进行重复实验，这比低力实验更困难，因为接近僵局时系统的稳定性降低（特别是对于经常迅速脱轨的轨道行走分子马达[16]、[24]，导致轨迹记录提前终止）。正如方程2所建议的，从低力或零力操作中可以获得马达的停滞力，这为通过单分子机械实验中的低力轨迹，甚至是从相对容易通过力无关的光学跟踪实验[27]、[28]（使用光学显微镜）获得的零力轨迹中获取马达的停滞力提供了可能性。这可能会显著降低实验测量停滞力和能效的难度，这两者是分子马达性能的两个重要指标。}

我们最近在[29]中使用一种新的轨迹分析方法证明了从低力或零力轨迹中提取分子马达停滞力的可行性。该方法将分子马达在反作用力下的轨迹映射到倾斜自由能轮廓上的偏置扩散，从而得到一个驱动能量，该能量可以提供马达停滞力的信息。使用两个分子马达模型的模拟轨迹以及人工DNA分子马达的真实轨迹[24]（来自依赖力的磁镊子实验）验证了成功的停滞力推导。然而，这种数值成功以及轨迹分析方法在很大程度上是经验性的，需要从物理原理出发的严格和概念清晰的基础。此外，验证该方法的三个马达都是用于平移运动的轨道行走分子马达。在这项研究中，我们改进了轨迹分析方法，并将其适用性扩展到旋转分子马达——特别是效率约为100%的F₁-ATPase转子及其实验轨迹（具有极高的方向性，因此需要改进的分析方法）。更重要的是，我们提出了基于Jarzynski等式的热力学研究，从而将数值推导出的驱动能量明确地与依赖力的热力学力（X_κ(f)相对应，并最终从F₁-ATPase马达的实验轨迹中再现了步进比的热力学极限（方程2）。这项严格的热力学涨落定理研究解释并巩固了统计方法从低力或零力轨迹推导分子马达停滞力（和能效）的能力。值得注意的是，该方法还绕过了获取正向-反向步进比P_f/P_b的实验难度，这是分子马达的一个重要性能指标，但迄今为止仍然难以获得。最后，基于Jarzynski等式的热力学研究为分析生物分子马达的进化优化性提供了一个全面的概念框架，并指导了当前高性能人工分子马达的蓬勃发展[30]、[31]、[32]。

部分摘录

分析具有极高方向性的旋转轨迹的数值方法

根据参考文献[29]中建立的统计方法，从分子马达的方向性单分子轨迹中提取了一个倾斜的有效势。对于像F₁-ATPase这样的分子转子，其旋转轨迹θ(t)，其中θ表示转子的角度（以度为单位），t表示时间，有效势为：$G_S\left(\theta \right)=k_{B}T\ln \frac{n_{\theta \to {\theta }_0}}{n_{{\theta }_0}}$

这里，θ₀是一个参考点，nθ→θ0是轨迹中从θ到θ_{0的转移事件数量，nθ0→θ}是

全步长缩放

来自单分子实验的分子马达在恒定反作用力下的轨迹可以映射到倾斜自由能轮廓上的偏置扩散。这种有效势是一个非平衡属性[33]，不同于平均力的势[34]，后者是一个平衡量。非平衡有效势如何有益于分子马达研究尚不清楚。最近我们引入了一种无参数的统计方法[29]来推导这种有效势

讨论与结论

总结来说，已经直接通过实验验证了分子马达步进比的热力学极限（方程1）。这一重要极限虽然是连接热力学力和循环流量的基本关系（方程1）的必然结果，但在分子马达实验中长期以来一直缺失，现在从F₁-ATPase的实验轨迹中得到了恢复。因此，这项研究消除了该领域长期存在的争议

CRediT作者贡献声明

侯瑞正：撰写——原始草稿、方法论、研究、资金获取、概念化。Toyabe Shōichi：验证、资金获取、数据管理。王志松：撰写——审稿与编辑、验证、研究、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了陕西省自然科学基础研究计划编号2024JC-YBMS-067、陕西省数学与物理基础科学研究项目编号23JSY002以及陕西省教育厅资助的科学研究计划编号22JP053（资助R. H.）的支持。本工作还得到了新加坡教育部和新加坡国立大学副校长（研究与技术）办公室的支持，资助编号为A-8000982-00-00