直接将肌动蛋白单体递送至目标位置是WASP蛋白特异性地激活Arp2/3复合体所必需的步骤

WASP家族蛋白通过招募单体激活Arp2/3复合体形成分支丝核，但直接招募单体的必要性存在物种差异。本研究揭示人类Arp2/3复合体通过构象变化无需WASP即可形成核，而酵母中该过程需直接招募单体，动力学模型显示两种机制激活速率相近。

Sofia R. Carlson | Brad J. Nolen

俄勒冈大学分子生物学研究所化学与生物化学系，尤金，美国

摘要

WASP家族蛋白通过激活Arp2/3复合体来在多种细胞过程中形成分支肌动蛋白纤维。WASP蛋白通过其保守的WASP同源域2将肌动蛋白单体招募到Arp2/3复合体中，但这些被招募的单体如何促进Arp2/3复合体的激活至今尚不清楚。先前的研究表明可能存在物种特异性差异：对人类Arp2/3复合体的研究表明，WASP直接递送肌动蛋白单体是组装纤维核所必需的，而针对出芽酵母Arp2/3复合体的研究则表明，直接招募单体仅是WASP介导的激活所必需的，并非激活的基本条件。在这里，我们发现将人类Arp2/3复合体中的肌动蛋白相关亚基（Arp2和Arp3）转变为类似纤维的构象后，即使没有WASP也能实现纤维的组装。这表明WASP直接递送单体并非形成纤维核的基本条件，而是WASP介导的激活的特定要求——这与酵母Arp2/3复合体的研究结果一致。利用肌动蛋白聚合的动力学模型，我们提供了证据表明，虽然Arp2-Arp3类似纤维的二聚体不足以实现人类Arp2/3复合体的纤维化，但在没有招募肌动蛋白单体的情况下，肌动蛋白单体仍能扩散并结合到复合体上形成纤维核。这些结果表明，基于扩散的机制可以以接近直接递送肌动蛋白单体的速率刺激哺乳动物Arp2/3复合体的纤维化。这些结果为有无单体递送情况下的Arp2/3复合体激活提供了重要见解，并证明了激活的基本机制在真菌和哺乳动物物种之间是保守的。

引言

聚合的肌动蛋白纤维在细胞力的产生中起着关键作用。新的肌动蛋白纤维是在最初的几个肌动蛋白亚单位（或肌动蛋白的结构类似物）结合形成纤维核后形成的，纤维核是最小的寡聚体，其末端以与肌动蛋白纤维相同的速度延长¹。纤维核的生成受到严格调控，以控制肌动蛋白网络何时何地组装并决定其细胞结构²，这两点对于定义细胞骨架功能至关重要。虽然已经鉴定出几种肌动蛋白纤维的成核因子，包括Arp2/3复合体、formins和串联WH2蛋白，但Arp2/3复合体是唯一已知能够形成分支肌动蛋白纤维的成核因子^{3, 4, 5}。由Arp2/3复合体组装的分支肌动蛋白网络驱动许多生物过程，包括内吞作用、细胞运动、自噬和组织形态发生^{6, 7, 8, 9, 10}。精确控制Arp2/3复合体的成核活性对于正确协调这些过程至关重要。

虽然Arp2/3复合体本身是不活跃的，但几类激活蛋白（即成核促进因子NPFs）可以触发其激活。最大的NPF类——I型或WASP家族NPFs——包括WASP、N-WASP、WAVE、WHAMM、JMY、WHIMP和WASH⁹等成员。WASP家族蛋白的特征是具有C端WCA（或VCA）序列（WH2、Central、Acidic），这是激活所需的最小区域^{11, 12}。WCA中的CA序列在两个不同的位点与Arp2/3复合体结合，两个位点的结合都是最大激活所必需的^{13, 14, 15, 16}。WH2序列与肌动蛋白单体结合，使WASP能够将第一个肌动蛋白亚单位递送到新纤维中¹¹。缺乏WH2区域的WASP构建体对Arp2/3复合体的激活作用较弱或完全无效，这表明在WASP介导的激活过程中，招募肌动蛋白单体是必要的^{11, 12}。重要的是，对直接招募的单体的需求建立了竞争性相互作用，这些相互作用调节了分支密度和Arp2/3组装的肌动蛋白网络中的WASP活性。首先，通过WASP和肌动蛋白纤维的带刺末端对未聚合单体池的竞争，限制了可以形成的分支数量，从而控制了网络中的分支密度¹⁸。其次，WH2结构域与肌动蛋白的结合建立了WASP和封端蛋白对纤维带刺末端的竞争，使封端蛋白通过阻止WASP与带刺末端的结合间接刺激WASP¹⁹。尽管这些调节作用至关重要，但WASP招募的肌动蛋白单体如何参与激活仍不清楚。

在触发成核之前，Arp2/3复合体必须与WASP、WASP招募的肌动蛋白单体以及现有的肌动蛋白纤维结合^{11, 20}。激活涉及两个主要的结构变化：Arp2和Arp3亚单位移动到与肌动蛋白纤维的短螺旋轴上的连续亚单位相匹配的排列（短螺旋构象），以及Arp2和Arp3亚单位的扁平化^{15, 21, 22, 23}。这些变化使Arp2-Arp3对在结构上模拟了纤维状肌动蛋白二聚体，并为新纤维的组装提供了模板。生化实验表明，WASP招募的肌动蛋白单体促进了Arp2/3复合体向短螺旋构象的转变，从而使复合体更接近成核状态，这可能是它们对激活的主要贡献^{15, 23, 24, 25}。然而，当研究人员将工程化的人类Arp2/3复合体交联以锁定在短螺旋状态时，它仍然不活跃，仍然需要WASP来激活¹⁵。这一发现表明，除了促进短螺旋状态外，WASP介导的激活过程中递送的肌动蛋白单体在触发成核中也起着第二个关键作用。

尽管这种额外作用的具体机制尚不清楚，但有一种模型提出，在任何NPF介导的激活过程中，直接招募肌动蛋白单体是构建肌动蛋白纤维核的基本要求。多项证据支持这一模型。例如，动力学建模显示，在自发肌动蛋白组装过程中，纤维核至少由三个或四个肌动蛋白亚单位组成¹，这表明Arp2-Arp3类似纤维的二聚体可能不足以构成纤维核。此外，对串联WH2类肌动蛋白纤维成核因子的研究表明，通过WH2序列直接连接和自我组装肌动蛋白单体是完成纤维核构建的可行机制^{4, 5, 27}。然而，一些数据反对在Arp2/3复合体介导的成核过程中需要直接递送肌动蛋白单体。例如，在出芽酵母Arp2/3复合体（ScArp2/3复合体）中，WASP在正常条件下必须直接递送肌动蛋白单体才能实现强效激活，但当复合体被交联到短螺旋构象时，ScArp2/3复合体即使没有WASP招募的肌动蛋白单体也能强效地形成肌动蛋白纤维²³。这些数据表明，直接递送肌动蛋白单体并非ScArp2/3复合体成核的基本要求，而是WASP介导的激活的特定要求。

这些明显的差异可能反映了不同物种间Arp2/3复合体在机制上的根本差异。生化和结构研究使用了纯化的人类、牛、出芽酵母、裂殖酵母和Acanthamoeba的Arp2/3复合体。除了上述的交联数据外，这些实验还揭示了不同物种之间的多种差异。例如，虽然来自酵母和哺乳动物的Arp2/3复合体在没有NPF的情况下仍保留一定的成核活性，但出芽酵母复合体的这种基础活性更强²⁸，这可能是由于它更倾向于形成短螺旋构象^{15, 23}。此外，哺乳动物的Arp2/3复合体通过Arp2亚单位的磷酸化进行调控^{29, 30}。虽然这些物种特异性差异可能是成核机制根本差异的表现，但也可能是进化上的微小适应，总体而言成核机制是保守的。在这里，我们结合了生化检测和动力学建模来区分这些可能性，并探讨了肌动蛋白单体递送在人类Arp2/3复合体成核中的作用。我们的数据阐明了在任何NPF介导的激活过程中，无论是否有单体递送，Arp2/3复合体如何组装肌动蛋白纤维核，并证明了成核机制的基本方面在酵母和哺乳动物复合体之间是保守的。

章节片段

即使在WASP存在的情况下，短螺旋交联的HsArp2/3复合体也可能不活跃

为了更好地了解招募的肌动蛋白单体如何影响人类Arp2/3复合体（HsArp2/3复合体）的活性，我们重新进行了Zimmet等人的短螺旋交联实验¹⁵。在该实验中，当复合体处于短螺旋构象时，Arp2（L199C）和Arp3（L117C）亚单位上的半胱氨酸残基会被交联。Zimmet的数据表明，用双马来酰亚胺乙烷（BMOE）处理双半胱氨酸工程化的HsArp2/3复合体会产生混合产物。

讨论

我们的数据表明，直接递送肌动蛋白单体是WASP特有的要求，并非Arp2/3激活的基本前提。为什么WASP需要直接递送单体而WDS家族蛋白不需要，可能与其不同的结合模式和释放要求有关。WASP蛋白必须在成核前释放，因为它们的结合与最终的成核状态不相容^{15, 22, 33, 39}。相比之下，WDS蛋白在整个激活过程中保持结合状态

克隆、蛋白质表达和纯化

如前所述，从兔肌肉丙酮粉中纯化肌动蛋白，并用芘碘乙酰胺标记⁴¹。N-WASP-VCA（C431A）和GST-N-WASP-VCA也按照先前的方法进行了纯化²³。人类SPIN90（269-722）的纯化方法也进行了相应调整⁵²，具体修改如下：蛋白质从Resource 30Q柱子上通过50至400 mM NaCl的盐梯度洗脱。经过谷胱甘肽琼脂糖柱后，蛋白质在Superdex 75柱上进行纯化

交联实验

双半胱氨酸Arp2/3复合体在1x KMEI（10 mM Imidazole-HCl pH 7.0, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂）和0.2 mM ATP中孵育5分钟，然后加入50倍摩尔量的双马来酰亚胺乙烷（BMOE）。反应在室温下进行，并用2 x SDS缓冲液淬灭用于Western blot分析，或用1 mM DTT淬灭用于芘聚合分析。Western blot分析在10-20% SDS-PAGE梯度凝胶上进行，过夜转移到硝酸纤维素膜上

芘肌动蛋白聚合实验

芘肌动蛋白聚合实验在96孔黑色平底半面积板（Corning 3686）上进行，使用TECAN Safire 2板读数器，激发波长为365 nm，发射波长为407 nm。将10x M/E缓冲液（5 mM MgCl₂, 20 mM EGTA）加入兔骨骼肌肌动蛋白中（G缓冲液：5 mM Tris pH 8.0, 0.2 mM CaCl₂, 0.2 mM ATP, 0.2 mM DTT），并加入5%牛血清白蛋白（BSA），然后孵育2分钟。激活剂包括Arp2/3复合体和目标蛋白质

计算k_obs值的推导

宏观速率常数k_obs,SPIN90定义了SPIN90-Arp2/3复合体在稳态下形成带刺末端的速率。用于计算k_obs,SPIN90的方程基于图S5中显示的成核途径和值，假设肌动蛋白单体浓度恒定。

宏观速率常数k_obs,WASP定义了WASP-纤维-Arp2/3复合体在稳态下形成带刺末端的速率。用于计算k_obs,WASP的方程基于

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了Claude.ai工具来提高手稿的清晰度和语言表达。使用该工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

CRediT作者贡献声明

Sofia R. Carlson：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、资源准备、方法论设计、实验实施、数据分析、概念化。Brad J. Nolen：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、项目监督、方法论设计、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院的资助（项目编号R35-GM136319（B. J. N.）和T32-GM007759（S.R.C.）。我们感谢Mike Lynch在HsArp2/3复合体克隆方面的帮助，Scott Hansen在昆虫细胞表达方面的指导，Heidy Narvaez-Ortiz在GST N-WASP、N-WASP和BtArp2/3复合体纯化方面的协助（与Mousumi Akter合作），以及Charlotte DiGaetano对手稿的评论。