靶向降解组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）的蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）在胶质母细胞瘤治疗中的潜力评估
摘要
组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）在胶质母细胞瘤进展中发挥重要作用，使其成为有前景的治疗靶点。虽然HDAC8抑制剂（HDAC8is）在动物模型中能抑制胶质母细胞瘤生长并延长生存期，但它们并不能消除HDAC8蛋白。相比之下，HDAC8靶向PROTAC作为一种选择性HDAC8降解剂，可诱导HDAC8的蛋白酶体降解，从而消除其所有功能。本研究旨在探讨先前报道的一种HDAC8 PROTAC在胶质母细胞瘤细胞中的抗肿瘤活性及其潜在机制。
引言
胶质母细胞瘤是最常见且具侵袭性的脑癌类型，预后差，全球5年生存率低于17%。标准治疗方案替莫唑胺（TMZ）联合放疗的中位总生存期仅为14.6个月，无进展生存期（PFS）为6.9个月。因此，迫切需要开发新的治疗策略以克服这些挑战并改善患者预后。
组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是一类能够去乙酰化组蛋白和非组蛋白的酶。HDAC抑制剂（HDACis）已在多种癌症中显示出抗癌效果。帕比司他（Vorinostat，suberoylanilide hydroxamic acid）作为一种泛HDACi，对人胶质母细胞瘤U-87 MG细胞具有活性，并且是首个进入胶质母细胞瘤治疗临床试验的HDACi。然而，其非选择性导致了显著的3-4级毒性，特别是血小板减少症、中性粒细胞减少症、白细胞减少症和疲劳，这凸显了开发亚型特异性HDACis以减少不良事件的必要性。
HDAC8是I类HDAC，能够去乙酰化非组蛋白。其抑制或敲低可降低U-87 MG和T98G胶质母细胞瘤细胞的活力，而抑制HDAC8能延长胶质母细胞瘤荷瘤小鼠的生存期，表明HDAC8在胶质母细胞瘤中的关键作用。值得注意的是，除了其酶活性外，HDAC8还具有支架功能。它与其它转录因子相互作用，这些因子参与癌症的发生发展。在胶质母细胞瘤中，HDAC8与蛋白酶体受体粘附调节分子1（ADRM1）相互作用，促进DNA损伤修复并导致TMZ耐药。因此，传统抑制剂对HDAC8催化功能的破坏可能无法完全抑制该酶的致瘤活性。
为克服此局限，本研究团队开发了一种选择性HDAC8 PROTAC（化合物1），其通过连接NCC-149衍生的HDAC8选择性抑制剂（化合物2）与常用于PROTACs的E3连接酶招募部分泊马度胺（Pomalidomide，化合物3）而构成。该HDAC8 PROTAC能通过泛素-蛋白酶体系统选择性诱导HDAC8降解，并在T细胞白血病（Jurkat）细胞中显著抑制细胞生长。这种选择性通过酶催化实验和细胞实验均得到证实。自该HDAC8 PROTAC报道以来，其他几种HDAC8 PROTACs也被开发出来，并显示出能抑制HDAC8的催化和支架功能。鉴于已报道HDAC8 PROTACs取得的可喜成果，其在HDAC8驱动癌症（包括T细胞白血病、乳腺癌和神经母细胞瘤）中的抗癌效果正在被研究。然而，HDAC8 PROTACs在胶质母细胞瘤细胞中的抗癌效果尚未见报道。因此，本研究评估了先前开发的HDAC8 PROTAC（化合物1）在胶质母细胞瘤细胞中的抗癌效果。
材料与方法
化学品与试剂：HDAC8 PROTAC（1）、NCC-149衍生的HDAC8i（2）和帕比司他均在日本大阪大学SANKEN研究所的Takayoshi Suzuki博士实验室合成。泊马度胺购自MedChemExpress。所有试剂均溶于二甲基亚砜（DMSO）。
细胞系与培养：人胶质母细胞瘤细胞系U-87 MG、A172和T98G购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。原代人星形胶质细胞（PHA）作为正常星形胶质细胞代表，在加拿大阿尔伯塔大学Christopher Power博士实验室制备。细胞在含10%胎牛血清（FBS）及相应补充物的培养基中，于37°C、5% CO2湿润环境下培养。
细胞活力测定：采用MTT法评估测试化合物在U-87 MG、A172、T98G细胞和PHA中的细胞毒性。计算半数抑制浓度（IC50）。
细胞增殖分析：使用CytoLabeling Deep Red试剂，通过Incucyte®活细胞分析系统和流式细胞术评估测试化合物的抗增殖效果。
细胞周期分析：通过碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术分析U-87 MG细胞的细胞周期分布。
凋亡细胞检测：使用Annexin V-PE和7-AAD染色，通过流式细胞术检测凋亡细胞。
Caspase-3/7活性检测：使用Caspase-3/7染料，通过Incucyte®活细胞分析系统实时监测caspase-3/7的激活。
蛋白质印迹法（Western Blotting）：用于定量HDAC8、细胞周期和凋亡关键调节蛋白（如Cdks、cyclins、Bcl-2、Bax、LC3、XBP1s、BiP、CHOP、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK）的水平。计算半数降解浓度（DC50）。
统计分析：数据以均值±标准差表示，使用GraphPad Prism进行单因素方差分析及Tukey-Kramer事后检验，p < 0.05认为有统计学意义。
结果
HDAC8 PROTAC（1）降低胶质母细胞瘤细胞活力
HDAC8 PROTAC（1）以剂量依赖方式降低U-87 MG、A172和T98G细胞的活力，其IC50值分别为6.12 ± 1.52 μM、6.25 ± 1.83 μM和22.68 ± 10.36 μM。在U-87 MG细胞中，其细胞毒性作用强于HDAC8i（2）和帕比司他，效力分别约为HDAC8i（2）的10倍和帕比司他的3倍，而泊马度胺（3）无细胞毒性作用。联合使用HDAC8i（2）和泊马度胺（3）对细胞活力无影响，表明细胞毒性作用特异性地由HDAC8 PROTAC（1）介导。
HDAC8 PROTAC（1）对胶质母细胞瘤细胞显示出选择性细胞毒性
与PHA相比，HDAC8 PROTAC（1）（5 μM和10 μM）处理能显著降低U-87 MG细胞的活力，但对PHA的活力影响极小。在5 μM和10 μM浓度下，PHA的活力分别比U-87 MG细胞高约2倍和3倍。HDAC8i（2）和泊马度胺（3）在胶质母细胞瘤细胞和PHA间无选择性细胞毒性差异。帕比司他在两种细胞中均导致活力下降，但其对癌细胞的选择性低于HDAC8 PROTAC（1）。
HDAC8 PROTAC（1）抑制胶质母细胞瘤细胞增殖
活细胞成像和流式细胞术分析显示，HDAC8 PROTAC（1）处理导致U-87 MG细胞数量随时间减少，同时荧光强度保持高位，表明细胞增殖受到抑制。HDAC8i（2）或泊马度胺（3）处理未观察到类似现象。帕比司他处理也减少了细胞数量，但伴随荧光信号的轻微下降。定量分析证实，HDAC8 PROTAC（1）处理组的平均荧光强度显著高于对照组及其他化合物处理组。
HDAC8 PROTAC（1）通过调控Cdk和Cyclin水平介导胶质母细胞瘤细胞S期阻滞
流式细胞术分析显示，HDAC8 PROTAC（1）以剂量依赖方式增加U-87 MG细胞S期比例。HDAC8i（2）、泊马度胺（3）或帕比司他处理未引起细胞周期阻滞。蛋白质印迹分析表明，仅HDAC8 PROTAC（1）处理能显著降低HDAC8、Cdk1、Cdk2、Cdk4、Cdk6和cyclin B1的水平，而对cyclin A2和cyclin E水平无影响。这表明HDAC8 PROTAC（1）通过调节Cdks和cyclins的表达影响细胞周期调控，介导S期阻滞。
HDAC8 PROTAC（1）诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡
流式细胞术分析显示，HDAC8 PROTAC（1）处理显著增加U-87 MG细胞的凋亡比例，其诱导的凋亡水平高于帕比司他（1.3倍）。同时，也引起较低水平的坏死。活细胞成像检测caspase-3/7活性显示，HDAC8 PROTAC（1）以剂量和时间依赖方式增强caspase-3/7活性。HDAC8 PROTAC（1）诱导caspase-3/7激活的能力强于帕比司他，而HDAC8i（2）和泊马度胺（3）无此作用。
HDAC8 PROTAC（1）在胶质母细胞瘤细胞中降解HDAC8的能力
蛋白质印迹分析显示，HDAC8 PROTAC（1）以时间和剂量依赖方式降低U-87 MG细胞中HDAC8的水平，其DC50为77.7 ± 24.12 nM。HDAC8i（2）、泊马度胺（3）或其组合均不能降低HDAC8水平，证实HDAC8降解由HDAC8 PROTAC（1）特异性介导。
HDAC8 PROTAC（1）降低Bcl-2并触发胶质母细胞瘤细胞内质网（ER）应激
蛋白质印迹分析显示，HDAC8 PROTAC（1）处理显著降低抗凋亡蛋白Bcl-2和HDAC8的水平，但不影响促凋亡蛋白Bax和自噬标志物LC3的水平。此外，HDAC8 PROTAC（1）处理上调了ER应激标志物BiP、IRE1α激活标志XBP1s以及下游促凋亡介质CHOP的表达。HDAC8i（2）或泊马度胺（3）处理对这些蛋白水平无影响。
HDAC8 PROTAC（1）激活胶质母细胞瘤细胞中的JNK通路
蛋白质印迹分析显示，HDAC8 PROTAC（1）处理24小时后，磷酸化JNK（p-JNK）与总JNK的比值显著升高。而磷酸化ERK（p-ERK）与总ERK的比值在各处理组间无差异。这表明HDAC8 PROTAC（1）激活了IRE1α/XBP1s介导的ER应激通路下游的JNK信号通路，而非ERK通路。
讨论
本研究显示，HDAC8 PROTAC（1）在胶质母细胞瘤细胞中表现出比传统HDAC8抑制剂（2）和帕比司他更强的细胞毒性，该作用主要通过诱导IRE1α/XBP1s–JNK–CHOP通路介导的ER应激性凋亡实现。此外，HDAC8 PROTAC（1）通过下调Cdk1、Cdk2、Cdk4、Cdk6和cyclin B1，有效抑制细胞增殖并诱导S期阻滞。值得注意的是，PHA对HDAC8 PROTAC（1）不敏感，突出了其作为胶质母细胞瘤选择性靶向治疗的潜力。
HDAC8 PROTAC（1）有效降解HDAC8的发现与其他研究一致。其在胶质母细胞瘤细胞中的细胞毒性作用在微摩尔范围内，与其他报道的HDAC8 PROTACs在实体瘤细胞中的效果相似。HDAC8 PROTAC（1）比帕比司他和HDAC8i（2）具有更强的细胞毒性和抗增殖作用，提示HDAC8的非催化功能对胶质母细胞瘤进展至关重要。这与HDAC8在其它癌症中通过支架功能发挥作用的报道相符。本研究首次提示HDAC8可能在胶质母细胞瘤细胞存活中具有非催化功能，需进一步研究验证。
HDAC8 PROTAC（1）诱导的S期阻滞可能源于Cdk2、Cdk1和cyclin B1的缺失（这些蛋白对S期进程和完成以及G2/M期启动至关重要），以及HDAC8功能破坏可能恢复p53活性和p21介导的细胞周期阻滞。HDAC8 PROTAC（1）诱导的凋亡与Bcl-2下调相关，且未影响自噬。ER应激的触发以及IRE1α/XBP1s–JNK–CHOP通路的激活表明，HDAC8 PROTAC（1）通过该通路诱导胶质母细胞瘤细胞发生ER应激介导的凋亡。
HDAC8 PROTAC（1）对胶质母细胞瘤细胞的选择性细胞毒性可能归因于其靶向降解HDAC8。帕比司他因其非选择性抑制与显著血小板减少症相关，而HDAC8 PROTAC（1）的亚型特异性降解可能提供更好的安全性，但仍需进一步评估其对血细胞的影响。
本研究调查了HDAC8 PROTAC（1）在胶质母细胞瘤细胞中的药理作用，结果支持其作为有前景的胶质母细胞瘤治疗候选药物。尽管包括PROTACs在内的高分子量化合物通常脑渗透性有限，但一种脑渗透性PROTAC目前正处于临床研究阶段。HDAC8靶向PROTAC是否能穿透血脑屏障值得关注。然而，当前研究仅基于体外实验，需要进一步的体内研究（包括效力、药代动力学、脑渗透性和毒性评估）来评估HDAC8 PROTAC（1）的治疗潜力并支持其进入临床开发。
结论
HDAC8 PROTAC（1）诱导的HDAC8降解通过调节Cdks和cyclins水平、抑制细胞周期调节蛋白、诱导S期阻滞，对人胶质母细胞瘤细胞产生强效和选择性的抗增殖及细胞毒性作用。同时，它激活IRE1α/XBP1s–JNK–CHOP通路，下调Bcl-2，诱导人胶质母细胞瘤细胞发生ER应激介导的凋亡。值得注意的是，HDAC8 PROTAC（1）对癌细胞表现出比原代人星形胶质细胞更大的选择性细胞毒性。这种对PHA的有限毒性提示了其安全性，并凸显了HDAC8 PROTAC（1）治疗胶质母细胞瘤的潜力。
