Abstract
Introduction 结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一，其发生发展受遗传、生活方式、饮食习惯及肠道微环境等多种因素影响。熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic Acid, UDCA）作为一种天然胆汁酸，具有抗炎、抗氧化和免疫调节特性，但其直接抗结直肠癌的具体分子机制尚不完全清楚。
Methods 本研究采用网络药理学、分子对接和体内实验验证相结合的整合策略，在AOM/DSS诱导的小鼠结直肠癌模型中探讨UDCA的分子靶点及其对肠道微环境的影响。
Results UDCA显著缓解了结肠炎相关肿瘤发生，降低了肿瘤负荷，该作用与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路相关。分子对接和实验验证确定EGFR是UDCA直接作用的关键上游靶点，从而抑制该致癌轴。此外，UDCA治疗改善了肿瘤微环境，表现为促炎细胞因子（如TNF-α, IL-6）受到抑制，代谢相关基因（CYP19A1, HMGCR等）表达得到调节，并通过富集有益菌群（如乳酸杆菌属 Lactobacillus）和增加短链脂肪酸（SCFAs）水平促进肠道菌群稳态。
Conclusion 这些发现表明，UDCA主要通过直接抑制EGFR介导的PI3K/Akt/mTOR通路发挥抗肿瘤作用，同时部分恢复肠道免疫代谢微环境。该研究为UDCA在结直肠癌治疗中的应用提供了新的机制见解。
Introduction
结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。近年来，肠道菌群失调和慢性炎症被证实是该病的重要风险因素。因此，寻找能够调节肠道微环境、抑制炎症反应并具有抗癌活性的治疗药物成为结直肠癌研究的关键焦点。UDCA是一种天然胆汁酸，以其调节胆汁酸代谢以及抗炎、抗氧化和免疫调节特性而广为人知。然而，尽管UDCA的一般抗炎和调节菌群作用已有记载，但其直接抗肿瘤活性的精确分子机制，特别是是否通过靶向特定致癌受体来破坏细胞内增殖信号，尚不完全清楚。PI3K/Akt/mTOR信号通路是细胞增殖和存活的核心调节器，其过度激活是结直肠癌发生的关键驱动因素。UDCA是否能通过直接靶向EGFR介导的PI3K/Akt/mTOR轴来缓解结直肠癌，尚未有系统研究。
Materials and Methods
研究利用PubChem、UniProt、GeneCards、BATMAN-TCM、DAVID等多个数据库进行网络药理学分析。通过SwissTargetPrediction和BATMAN-TCM预测UDCA靶点，并与GeneCards中的结直肠癌相关靶点取交集，获得129个共同靶点。利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape进行可视化及核心靶点（如SRC, ESR1, EGFR, PPARA, RXRA, NR0B2, RARA, HMGCR, CYP19A1）筛选。进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。采用MOE 2019软件进行分子对接，评估UDCA与核心靶点的结合能和相互作用模式。
动物实验使用50只雄性Balb/c小鼠，随机分为正常组、模型组、UDCA低剂量（60 mg/kg）、中剂量（90 mg/kg）和高剂量（120 mg/kg）组。通过腹腔注射AOM（10 mg/kg）和饮用3% DSS溶液诱导结直肠癌模型。UDCA从第8天开始每日灌胃给药。监测体重，实验结束后收集血清、结肠组织。通过ELISA检测血清炎症因子（TNF-α, IL-6, IL-4, IFN-α）水平；H&E染色观察结肠组织病理形态；qRT-PCR检测结肠组织中CYP19A1、HMGCR、RARA、NR0B2和EGFR的mRNA表达；Western Blot检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白（p-PI3K, PI3K, p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR）及下游效应蛋白（Bax, Bcl2, Cyclin D, p-S6K1）的表达；对粪便样本进行16S rRNA高通量测序分析肠道菌群多样性及组成；通过气相色谱（GC）检测肠道内容物中短链脂肪酸（SCFAs）含量。数据采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.02进行统计分析。
Experimental Results
Results of Network Pharmacology Experiments
网络药理学分析显示，UDCA与结直肠癌存在129个共同靶点。PPI网络拓扑分析确定了9个核心靶基因：SRC、ESR1、EGFR、PPARA、RXRA、NR0B2、RARA、HMGCR和CYP19A1。GO富集分析表明UDCA可能通过调节细胞内受体信号通路、基因转录、类固醇代谢等生物过程影响结直肠癌进展。KEGG通路富集分析提示UDCA可能通过PPAR信号通路、Th17细胞分化、胆汁分泌、化学致癌受体激活等多条通路发挥治疗作用。
Molecular Docking Results
分子对接结果显示，UDCA与9个核心靶蛋白均表现出良好的结合活性（结合能-5.5532 至 -8.3927 kcal/mol）。其中，与CYP19A1（-8.3927 kcal/mol）和HMGCR（-7.0162 kcal/mol）的结合能最强。UDCA与这些靶点的结合主要通过氢键和疏水相互作用实现。特别值得注意的是，UDCA与EGFR具有较好的结合能（-6.5234 kcal/mol），提示其可能直接作用于EGFR。
Animal Experiment Results
Effects of UDCA on Body Weight, Colon Length and Colon Tissue Pathology in Mice with Colorectal Cancer
AOM/DSS诱导导致小鼠体重显著减轻、结肠长度明显缩短（P < 0.01）。UDCA给药以剂量依赖性的方式缓解了体重下降和结肠缩短，高剂量组效果最为显著（P < 0.01）。组织病理学显示模型组出现炎性细胞浸润、隐窝结构扭曲、杯状细胞减少等典型病变，而UDCA治疗，尤其是高剂量组，显著改善了结肠黏膜结构，炎症浸润明显减轻。
Regulatory Effect of UDCA on Serum Inflammatory Factors in Mice with Colorectal Cancer
模型组血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-4水平显著升高（P < 0.01），而抗肿瘤细胞因子IFN-α水平显著降低（P < 0.01）。UDCA治疗，尤其是中、高剂量，能剂量依赖性地降低TNF-α、IL-6和IL-4水平，并恢复IFN-α水平至接近正常（P < 0.01）。
Effect of UDCA on the mRNA Expression Levels of CYP19A1, HMGCR, RARA, NR0B2 and EGFR in Colon Tissue of Mice with Colorectal Cancer
与空白组相比，模型组CYP19A1 mRNA表达显著下调（P < 0.01），而HMGCR、NR0B2和EGFR mRNA表达显著上调（P < 0.01）。RARA表达无显著变化。UDCA治疗（中、高剂量）能显著逆转CYP19A1的下调以及HMGCR、NR0B2和EGFR的上调（P < 0.01），使其表达水平接近空白组。低剂量UDCA对EGFR的下调作用较弱（P < 0.05）。RARA表达在各组间无差异。
Effect of UDCA on the Expression of Phosphorylated Proteins of PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway in Colon Cancer Tissues of Mice
Western Blot结果显示，与对照组相比，模型组结肠癌组织中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白磷酸化水平显著升高（P < 0.01），而总蛋白水平无变化。UDCA治疗以剂量依赖性的方式显著降低了p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的磷酸化水平（P < 0.01）。下游功能效应蛋白分析显示，UDCA处理增加了促凋亡蛋白Bax的表达，降低了抗凋亡蛋白Bcl2的表达，从而改善了Bax/Bcl2比值；同时显著抑制了细胞周期蛋白Cyclin D和mTOR下游底物p-S6K1的磷酸化水平（P < 0.01）。
Effect of UDCA on Intestinal Flora in Mice with Colorectal Cancer
AOM/DSS建模显著降低了肠道菌群的α多样性（Chao1指数和Shannon指数，P < 0.01）。UDCA干预显著恢复了菌群多样性（P < 0.01）。主坐标分析（PCoA）显示模型组与对照组菌群结构存在显著差异，UDCA处理组菌群结构更接近于对照组。在属水平上，模型组有益菌如拟杆菌属（Bacteroides）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）丰度显著降低（P < 0.01），而条件致病菌如假单胞菌属（Pseudomonas）和螺杆菌属（Helicobacter）丰度显著升高（P < 0.01）。UDCA治疗显著逆转了这种菌群失调，增加了有益菌丰度，降低了致病菌丰度（P < 0.01）。
UDCA Restores Intestinal Metabolic Homeostasis by Upregulating Short-Chain Fatty Acids
与对照组相比，模型组结肠内容物中总短链脂肪酸（SCFAs）以及乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸等各组分含量均显著降低（P < 0.01）。UDCA治疗显著上调了这些SCFAs的水平（P < 0.01），使其含量恢复至接近健康对照组水平。
Discussion
本研究通过整合网络药理学、分子对接和体内实验，揭示了UDCA抗结直肠癌的多靶点作用机制。网络药理学预测和分子对接表明UDCA可能直接作用于EGFR、CYP19A1、HMGCR等多个核心靶点。体内实验证实UDCA能有效缓解AOM/DSS诱导的结直肠癌，其作用与抑制EGFR/PI3K/Akt/mTOR信号通路、调节炎症因子、恢复肠道菌群稳态和SCFAs代谢密切相关。特别重要的是，本研究首次提出EGFR是UDCA的直接作用靶点之一，UDCA可能作为一种天然的EGFR抑制剂发挥作用。UDCA对CYP19A1表达的恢复作用可能与其改善炎症微环境相关。肠道菌群分析表明UDCA能逆转结直肠癌相关的菌群失调，富集有益菌，减少致病菌，这可能与其改善肠道屏障功能和免疫调节有关。SCFAs水平的恢复进一步佐证了UDCA对肠道代谢稳态的正向调节作用。本研究为UDCA的临床抗肿瘤应用，尤其是作为结直肠癌预防或辅助治疗策略，提供了坚实的实验依据和新的分子见解。研究的局限性包括微生物组样本量有限、缺乏对T细胞亚群的直接分析以及AOM/DSS模型主要模拟炎症相关癌变等。未来研究需要更大样本量、更深入的机制探索以及在散发性结直肠癌模型中的验证。
Conclusions
本研究结果表明，UDCA主要通过直接抑制EGFR介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路，并部分恢复肠道免疫代谢微环境（包括调节炎症因子、肠道菌群和SCFAs），从而在结直肠癌模型中发挥治疗作用。这些发现为UDCA的临床抗肿瘤应用提供了新的机制见解。未来研究应关注UDCA与现有化疗方案的协同效应，并验证所观察到的微生物和代谢改变与疗效之间的因果关系。
Ethics Approval and Consent to Participate
动物实验经南昌医学院实验动物伦理委员会批准（NYLLSC20241206）。网络药理学所用数据均来自公开数据库，符合相关法规豁免IRB审查的要求。
Author Contributions
所有作者均对研究工作有实质性贡献。
Disclosure
所有作者声明无利益冲突。
Data Sharing Statement
支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获取。
