从苯并[γ]喹啉多靶点抗癌骨架到高效的苯并[γ]吡啶并[4,5-b]喹啉衍生物：针对野生型和突变型EGFR的靶向治疗研究——综合计算分析、分子信号调控及基因表达网络的见解

本研究基于苯并[a]喹啉并[4,5-b]喹啉酮骨架开发多靶点抗癌剂，鉴定化合物10为强效候选药物。其体外抑制MCF-7细胞活性（IC50=5.82±0.4 µM），优于索拉非尼，并有效抑制EGFR野生型及L858R/T790M突变体（IC50=0.188±0.013 µM）。分子对接和动力学模拟显示化合物10与EGFR结合稳定，电子结构优化且耐药突变耐受。

哈加尔·S·埃尔-赫玛（Hagar S. El-Hema）、哈迪尔·M·埃尔-费基（Hadeer M. El Fekey）、穆罕默德·A·哈瓦塔（Mohamed A. Hawata）、莫达瑟·F·侯赛因（Modather F. Hussein）、艾哈迈德·T·埃尔亨达维（Ahmed T. Elhendawy）和阿德尔·A.-H·阿卜杜勒-拉赫曼（Adel A.-H. Abdel-Rahman）

埃及开罗玛迪（Maadi 11434）的忒拜高等工程学院（Thebes Higher Institute for Engineering）化学系（Basic Science Department, Chemistry）

摘要

本研究探讨了苯并[g]吡啶[4,5-b]喹啉骨架作为开发多靶点抗癌药物的有希望的平台，并确定化合物10为最具潜力的候选分子。化合物10在体外对MCF-7乳腺癌细胞表现出强烈的细胞毒性（IC50 = 5.82 ± 0.4 µM），其效果与多柔比星相当，优于索拉非尼。酶学检测证实该化合物能有效抑制野生型EGFR（IC50 = 0.188 ± 0.013 µM），同时对临床相关的L858R和T790M突变体也具有抑制作用（IC50分别为0.121 ± 0.008 µM和0.162 ± 0.034 µM），显示出良好的耐药性。机制研究表明，该化合物能显著阻断G0/G1细胞周期并诱导细胞凋亡，同时上调BAX和DUSP6蛋白的表达，下调CCND1蛋白。计算模拟结果也支持了实验发现，表明该化合物具有良好的ADMET（吸收、分布、代谢和排泄）特性及药物类似性。分子对接实验显示其具有与EGFR WT和EGFR L858R/T790M强烈的结合亲和力，100纳秒的分子动力学模拟进一步证实了其与突变体的稳定复合物形成。密度泛函理论、态密度分析、静电势和非共价相互作用分析表明，化合物10具有平衡的电子结构，能够在不产生过度电子反应的情况下有效结合靶点。相比之下，化合物13a表现出极强的电子极化性，是该系列中最具反应性的衍生物。总体而言，化合物10作为一种电子结构优化且耐突变的EGFR抑制剂，具有开发下一代抗癌药物的巨大潜力。

引言

癌症是全球主要的健康挑战之一，是仅次于心血管疾病的第二大死亡原因[[1], [2], [3]]。据世界卫生组织和GLOBOCAN的数据预测，到2025年全球将新增约2000万例癌症病例，导致近1050万人死亡[[4], [5], [6]]。

其中最具临床挑战性和普遍性的恶性肿瘤包括乳腺癌[[7], [8], [9]]、结直肠癌[[10], [11], [12]]和肝细胞癌[[13], [14], [15]]，本研究分别使用了MCF-7、HCT-116和HepG2细胞系进行探讨。尽管早期诊断和化疗方法有所进展，现有抗癌药物仍存在高毒性、选择性差、吸收率低以及易产生耐药性等显著局限性[[16], [17], [18], [19], [20]]。这些挑战凸显了迫切需要创新疗法来针对驱动肿瘤发生、增殖和进展的分子和遗传因素。

靶向癌症治疗的核心是表皮生长因子受体（EGFR）[[21], [22], [23], [24], [25], [26]]，它属于ErbB受体酪氨酸激酶家族，因其在临床中的重要性而受到广泛关注[[21], [22], [23], [24], [25], [26]]。EGFR的异常激活（如基因扩增或突变）在多种恶性肿瘤中普遍存在，包括非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌和结直肠癌。EGFR在调节细胞增殖、存活和分化中起关键作用，但其异常激活以及L858R和T790M等耐药性突变的出现，仍然是有效癌症治疗的主要障碍[[27], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34]]。

几种获得FDA批准的EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如吉非替尼（gefitinib）、厄洛替尼（erlotinib）、卡尼替尼（canertinib）和拉帕替尼（lapatinib），均含有类似的喹唑啉/喹啉杂环结构，对野生型EGFR具有显著抑制作用[[35], [36], [37], [38]]。然而，这些药物的临床疗效常因耐药性突变而降低，这些突变会降低药物与靶点的结合亲和力。随后开发的EGFR抑制剂针对T790M和C797S等突变体[[39], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47], [48], [49]]。尽管取得了这些进展，但在多种EGFR突变背景下实现持久抑制仍是一个重大挑战，因此需要结构改良且耐突变的化学骨架。

在药物化学领域，富含氮的融合杂环化合物因其结构刚性、平面性和能够在激酶活性位点建立关键相互作用而受到广泛关注。其中，吡啶[2,3-d]吡啶、二氢苯并[g]吡啶[4,5-b]喹啉和5,10-二氢苯并[g]喹啉被视为有前景的EGFR抑制剂骨架。特别是吡啶[2,3-d]吡啶衍生物在这一类化合物中研究最为深入，许多类似物对野生型EGFR及临床相关的L858R和T790M突变体均表现出强抑制作用[[50], [51], [52], [53], [54]]。它们能够与ATP结合位点相互作用，尤其是通过氢键与Met793残基结合，这使其成为经过验证的EGFR药效团。这些特性为基于吡啶[2,3-d]吡啶的分子结构设计新EGFR抑制剂提供了有力依据。

鉴于这一成功的先例以及吡啶[2,3-d]吡啶药效团的明确相互作用特征，本研究选择其作为设计新型三环EGFR抑制剂的参考骨架。因此，本研究将经过验证的吡啶吡啶类EGFR抑制剂的药效团元素整合到更刚性的二氢苯并[g]喹啉和二氢苯并[g]吡啶[4,5-b]喹啉骨架中。这种骨架扩展和生物等效性优化策略旨在评估增强分子刚性和优化杂环结构是否能够提高激酶结合亲和力、增强抑制效力，并可能克服与临床相关EGFR突变（尤其是L858R和T790M）相关的耐药性。

近期研究展示了这些骨架中代表性抑制剂的活性。例如，二氢苯并[g]喹啉衍生物EGFR L858R/T790M抑制剂VI的IC50值为0.053 ± 0.002 µM和0.026 ± 0.001 µM，而厄洛替尼的IC50值分别为0.045 ± 0.001 µM和0.443 ± 0.002 µM[[55]]。同样，吡啶[2,3-d]吡啶衍生物VII对野生型EGFR的IC50值为3.5 nM（相比之下，奥西美替尼的IC50值为1290 nM[[56]]，而VIII和IX对野生型EGFR/T790M的抑制作用分别为0.099 ± 0.007 µM和0.123 ± 0.010 µM（厄洛替尼的IC50值为0.043 ± 0.003 µM和0.071 ± 0.006 µM[[57,58]]。这些研究突显了这些骨架在靶向野生型和突变型EGFR方面的药理潜力（图1）。

相比之下，二氢苯并[g]吡啶[4,5-b]喹啉和5,10-二氢苯并[g]喹啉体系作为EGFR抑制剂骨架的研究仍相对较少，尽管有证据表明，超出经典喹唑啉骨架的扩展可以增强π–π堆叠、疏水相互作用和在EGFR活性位点的整体结合强度。尽管目前尚无基于这些三环骨架的FDA批准药物，但最新研究显示它们具有良好的抗癌潜力[[59], [60], [61], [62]]。

最新研究表明，通过结构修饰（如骨架刚性增强、氮元素富集和引入平面芳香基团）可以有效优化激酶活性位点的分子识别。这类设计方法与改善的靶点结合能力和增强的抗增殖活性相关。此外，综合实验和计算方法（包括分子对接、分子动力学模拟、密度泛函理论分析和计算机辅助ADMET分析）已被广泛用于这类化合物的结构优化和合理先导化合物开发。

综上所述，富含氮的融合杂环化合物作为设计下一代针对EGFR驱动的抗癌药物的有吸引力和多功能骨架具有明显优势，为本研究提供的设计策略提供了坚实的理论基础[[63], [64], [65]]。

基于先导化合物X的出色抗癌效果[[66]]，我们设计了一系列2-氨基-4-(4-氯苯基)-5,10-二氢苯并[g]喹啉-3-氰基衍生物。化学修饰主要集中在骨架的C-2和C-4位点，利用氰基和氨基官能团构建了多种融合杂环骨架，包括二氢苯并[g]喹啉、二氢苯并[g]吡啶[4,5-b]喹啉和吡啶吡啶骨架（图2）。在选定的反应中，分别对氰基或氨基进行选择性取代以获得定制的衍生物。所有化合物均对MCF-7、HCT-116和HepG2细胞系进行了细胞毒性测试，其中最有效的候选化合物进一步评估了其对野生型EGFR及突变体（L858R和T790M）的抑制作用。为了提供机制解释和预测药代动力学行为，进行了分子对接、分子动力学模拟、量子化学计算和ADMET分析。这种综合设计方法旨在评估骨架扩展和生物等效性修饰是否能够增强EGFR结合能力、提高抑制效力，并可能克服EGFR突变引起的耐药性。

化学部分

用于测量熔点、光谱数据（红外光谱、1H NMR、13C NMR、质谱和元素分析的仪器详细信息见ESI材料†。起始化合物2-氨基-4-(4-氯苯基)-5,10-二氢苯并[g]喹啉-3-氰基（A）的制备方法参照了相关文献[[67]]。

化学

方案1–4展示了新设计化合物1–13c的合成路线。在方案1中，苯并[g]喹啉衍生物（1–4）通过逐步法合成。合成过程从关键中间体2-氨基-4-(4-氯苯基)-5,10-二氢苯并[g]喹啉-3-氰基（A）开始，随后与乙酰丙酮、三乙基正甲酸酯、乙基氰基丙酸酯和马来酮腈等试剂反应。

结论

本研究确定5,10-二氢苯并[g]喹啉是抗癌药物设计的理想骨架，并指出衍生物10（一种6,11-二氢苯并[g]吡啶[4,5-b]喹啉类似物）是该系列中最有效的候选分子。化合物10对MCF-7乳腺癌细胞表现出强烈的细胞毒性，其活性与多柔比星相当，优于索拉非尼。它能有效抑制野生型EGFR及临床相关的耐药性突变体。

作者贡献

哈加尔·S·埃尔-赫玛（Hagar S. El-Hema）：概念构思；生物研究设计；监督；原始草稿撰写；审稿与编辑。哈迪尔·M·埃尔-费基（Hadeer M. El Fekey）：实验研究；资源协调；数据管理；部分原始草稿撰写。穆罕默德·A·哈瓦塔（Mohamed A. Hawata）：概念构思；方法设计；监督；审稿与编辑。艾哈迈德·T·埃尔亨达维（Ahmed T. Elhendawy）：分子对接；ADMET分析；分子动力学模拟；可视化处理。莫达瑟·F·侯赛因（Modather F. Hussein）：形式分析；密度泛函理论计算。阿德尔·A.-H·阿卜杜勒-拉赫曼（Adel A.-H. Abdel-Rahman）：

数据可用性

本研究的所有支持数据均包含在文章及其补充信息（SI）中。补充信息包括红外光谱、1H NMR、13C NMR和质谱数据（图S1–S51）、详细材料和方法（表S1–S11）以及TLC图像（图S52）。

CRediT作者贡献声明

哈加尔·S·埃尔-赫玛（Hagar S. El-Hema）：撰写——审稿与编辑、原始草稿撰写、可视化处理、验证、项目监督、方法设计、实验研究、形式分析、概念构思。哈迪尔·M·埃尔-费基（Hadeer M. El Fekey）：原始草稿撰写、实验研究。穆罕默德·A·哈瓦塔（Mohamed A. Hawata）：审稿与编辑、验证、监督。莫达瑟·F·侯赛因（Modather F. Hussein）：实验研究、形式分析、数据管理。艾哈迈德·T·埃尔亨达维（Ahmed T. Elhendawy）：形式分析、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者衷心感谢梅努菲亚大学（Menoufia University）化学系在整个研究过程中提供的实验室设施和技术支持。