物种形成分析揭示了暴露于亚砷酸盐的甲基化人类细胞中，砷化合物在细胞器内的分布情况

本研究通过亚细胞分馏结合形态分析，发现无机砷（iAs）在细胞各亚细胞器中占主导地位（>90%），其核内富集与甲基化效率降低相关，并显著抑制线粒体呼吸（IC50=4.2 μg/mL）。揭示了亚细胞分布对砷毒性的关键影响机制。

李一正|刘洪涛|于天天|刘家辉|孙金|张瑞佳|赵娜|胡立刚|陈宝伟|黄永顺|栾天刚

中国南方海洋科学与工程广东实验室，中山大学海洋科学学院，珠海，519082

摘要

通过饮用水摄入砷会带来严重的全球健康风险。为了阐明砷暴露引起的毒性效应，研究不同砷物种的亚细胞分布至关重要。本研究将暴露于亚砷酸盐（iAs^III）的砷甲基化L-02细胞物理分离成不同的亚细胞组分，并进行了砷形态分析。在所有亚细胞组分中均检测到无机砷（iAs）和单甲基砷化合物（MMAs），而未检测到双甲基砷化合物（DMAs）。无论在哪个亚细胞组分中，iAs都是主要存在的砷物种（占总砷含量的90.0%以上）。不同亚细胞组分中的iAs水平与细胞内总砷含量显著相关（p < 0.01）。随着iAs^III暴露浓度的升高，iAs的积累位置从细胞质转移到了细胞核。线粒体和细胞核中iAs的富集因子远高于MMAs。高浓度的iAs^III显著降低了L-02细胞的砷甲基化效率。甲基化指数与细胞活力或ATP生成之间存在显著相关性（p < 0.05）。因此，1.0 μg/mL的iAs^III显著抑制了与ATP生成相关的线粒体呼吸作用。我们的结果表明，甲基化效率可能是影响细胞内砷分布并引发相关细胞毒性的关键因素。

引言

砷（As）是一种广泛分布于地壳中的类金属元素，由于自然释放和人为排放，在环境介质中非常普遍[1]。全球约有2亿人面临饮用水中砷含量超过安全阈值的危险[2]。人类接触砷与多种疾病密切相关，例如心血管疾病、糖尿病和多种癌症[3]。美国环境保护署（US EPA）将砷列为第一类致癌物[4]。砷的毒性很大程度上取决于其化学形态[5]。实时细胞电生理传感系统显示，13种砷化合物的细胞毒性差异可达三个数量级[6]。三价砷化合物可以通过与巯基结合来破坏蛋白质功能[7]，五价砷化合物可能通过竞争性抑制磷酸盐转运蛋白来干扰能量代谢[7]。因此，砷形态分析对于了解砷暴露引起的有害健康影响至关重要。

无机砷（iAs）经历还原和甲基化反应的循环，生成单甲基砷酸（MMA^V）和二甲基砷酸（DMA^V）。三价甲基化砷化合物（如单甲基砷酸（MMA^III）和二甲基砷酸（DMA^III）也被认为是体内砷甲基化的关键中间产物，通常比iAs具有更高的细胞毒性[6]、[9]、[10]、[11]。然而，砷的甲基化有助于促进其排泄[12]。对各种人体样本（如尿液、血液和唾液）的砷形态分析表明，砷的甲基化与其有害效应密切相关[13]、[14]。据我们所知，目前尚未有关于亚细胞水平上砷化合物形态的分析报道。了解亚细胞器中砷物种的水平和分布有助于理解其毒性作用。

以往的研究主要集中在总砷含量[15]、[16]或细胞和组织水平上的砷形态分析[17]、[18]、[19]、[20]。细胞内iAs及其代谢物的分布特征却较少受到关注。准确评估砷的毒性需要超越全细胞分析的限制，因为砷化合物在亚细胞内的不同分布可能会决定其靶标特异性毒性[21]。iAs^III可以通过多种途径干扰线粒体功能，例如通过竞争性抑制丙酮酸脱氢酶（PDH）活性和活性氧（ROS）的过量产生[8]、[22]。值得注意的是，不同砷化合物的线粒体毒性存在很大差异。例如，MMA^III可以同时抑制大鼠肝RLC-16细胞中的复合物II和IV，而DMA^III则选择性地抑制复合物II[23]。在细胞核中，三价砷可以与核蛋白结合并改变其生化性质[24]、[25]，甲基化的三价代谢物可以强烈激活c-Jun转录因子，从而引发显著的基因毒性[26]。综上所述，这些研究强调了在亚细胞水平上进行形态解析定量分析的重要性。

本研究的目标是定量确定暴露于iAs^III的L-02细胞中iAs及其甲基化产物的亚细胞水平，以及探讨亚细胞砷形态与iAs^III细胞毒性之间的关系。

试剂和标准品

砷酸钠（NaAsO₂）标准品（1.0 mg as As /mL）购自中国国家计量院。碳酸氢铵（NH₄HCO₃）（Sigma-Aldrich）用作阴离子交换柱上分离砷物种的流动相。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，添加4.5 g/L葡萄糖）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶/EDTA（0.05%）和磷酸盐缓冲液（PBS，1×）购自Gibco（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。

细胞培养

L-02细胞系由...

L-02细胞对砷的吸收

首先，通过CCK-8检测法评估了iAs^III对L-02肝细胞的48小时细胞毒性。图S1a显示，当iAs^III的暴露浓度超过1.0 μg/mL时，会导致L-02细胞显著死亡，且这种效应具有良好的剂量依赖性（图S1b）。L-02细胞对iAs^III的IC₅₀值为4.2 μg/mL（图S1c）。根据iAs^III的细胞毒性结果，后续实验选择了相应的暴露浓度。

讨论

在生物系统中，iAs可以在肝细胞内发生生物转化[28]，主要生成甲基化砷化合物（如MMAs和DMAs）[29]。本研究表明，在砷甲基化L-02细胞的所有亚细胞组分中仅检测到iAs和MMAs。有报道称DMAs可以迅速从肝细胞中排出[30]，这导致细胞内DMAs的水平持续较低，我们的形态分析也证实了这一点。

结论

总结来说，在砷甲基化L-02细胞的所有亚细胞组分中均检测到iAs和MMAs。高浓度的iAs^III显著抑制了L-02细胞的砷甲基化效率，同时iAs优先积累在细胞核中。iAs的亚细胞分布模式与MMAs明显不同，且两者都随iAs暴露浓度的变化而显著改变。线粒体和细胞核中iAs的富集因子...

作者贡献声明

刘洪涛：撰写 – 审稿与编辑、方法学、概念构建。刘家辉：方法学、数据分析、数据管理。陈宝伟：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、方法学、资金获取、概念构建。李一正：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学、数据分析。于天天：方法学、数据分析。孙金：方法学、数据分析。张瑞佳：

利益冲突

不存在利益冲突，无需声明。

利益冲突声明

☒ 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号22276224和22127810）以及广东省职业病防治医院领军人才计划（Z2024-03）的财政支持。作者还感谢中山大学代谢平台的成员提供的技术协助。