代谢紊乱已被认为是肿瘤发生的重要驱动因素，尤其在代谢功能障碍相关脂肪肝病（MASLD）相关的肝细胞癌（HCC）中。然而，其背后的具体分子机制仍不甚明了。在这项发表于《Cell Reports》的研究中，谢晨熠等人通过磷酸化抗体芯片筛选，发现定位于溶酶体的胰岛素受体酪氨酸激酶底物（IRTKS）是代谢主调控因子mTORC1的关键激活因子。
为了探究IRTKS如何影响细胞信号传导，研究人员首先在稳定过表达IRTKS的HEK-293T细胞中进行了磷酸化特异性抗体微阵列分析。结果发现，在检测的148个磷酸化位点中，有7个位点的磷酸化水平增加了2倍以上，其中包括mTORC1的经典底物P70S6K（pT421）和4EBP1（pT45）。这一线索提示IRTKS可能选择性增强了mTORC1下游效应物的磷酸化。随后的实验在多种人癌细胞系（如肝癌MHCC97-H、胃癌AGS、肺癌A549）以及小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中均验证了IRTKS对mTORC1信号通路的激活作用，且这种激活具有剂量依赖性，并可被mTORC1抑制剂雷帕霉素所抑制。重要的是，IRTKS并不影响mTOR自身的磷酸化水平，也不影响mTORC2下游靶点如Akt（pS473）的磷酸化，表明其激活作用具有mTORC1特异性。
那么，IRTKS是如何精确调控mTORC1的呢？已知mTORC1的激活依赖于其在溶酶体膜上的定位。研究人员通过分析公共蛋白质相互作用数据库和细胞组分分离实验，意外地发现IRTKS定位于溶酶体。免疫荧光染色显示，内源性EGFP标记的IRTKS与溶酶体标记物LysoTracker及LAMP1存在显著共定位。进一步的机制研究表明，IRTKS通过其N端的I-BAR结构域与溶酶体膜上的磷脂酰肌醇磷酸（PIPs），特别是PI3P和PI5P结合，从而锚定在溶酶体膜上。更为有趣的是，IRTKS的C端含有一个内在无序区域（IDR），使其能够在溶酶体膜上发生液-液相分离，形成液态般的凝聚体。利用1,6-己二醇破坏相分离或构建相分离缺陷的IRTKS（P-to-A）突变体，均能显著削弱IRTKS与溶酶体膜的关联及其对mTORC1的激活能力，证明了LLPS在此过程中的必要性。
研究人员进一步探究了IRTKS凝聚体的功能。通过体外沉降实验和免疫共沉淀技术，他们发现IRTKS凝聚体能够特异性“招募”并富集mTORC1通路上的关键GTP酶RRAGD，而RRAGD正是氨基酸感知并激活mTORC1的核心元件。这种依赖于相分离的相互作用，增强了RRAGD与mTORC1核心组分mTOR和RPTOR的结合，从而在溶酶体膜上构建了一个局部的信号放大中心，提高了mTORC1对氨基酸（如亮氨酸）的响应灵敏度。当氨基酸充足时，IRTKS-RRAGD-mTORC1信号轴被强烈激活，促进蛋白质合成和脂质生成等合成代谢过程；而在氨基酸饥饿条件下，IRTKS的过表达则能延缓mTORC1信号衰减，维持其一定活性。
为了验证IRTKS-mTORC1轴在生理和病理状态下的功能，研究者构建了肝特异性Irtks过表达（IrtksLKI）和敲除（IrtksLKO）的小鼠模型。当饲喂高脂饮食（HFD）时，IrtksLKI小鼠表现出更严重的肥胖、肝脏脂肪变性、炎症细胞浸润以及肝功能指标（如ALT）升高，模拟了人类MASLD和MASH的病理特征。更重要的是，在长达18个月的常规饮食饲养后，43.3%的IrtksLKI小鼠自发发展为HCC。相反，IrtksLKO小鼠则对HFD诱导的代谢异常具有抵抗性，肝脏脂质堆积显著减轻。在Leptin缺陷的肥胖（Lepob/ob）小鼠模型中，通过腺相关病毒（AAV）介导的肝特异性Irtks敲低，同样能够有效缓解肝脏脂肪变性和损伤，并抑制mTORC1信号通路及其下游脂质合成相关基因的表达。所有这些由Irtks过表达引发的代谢异常和肝脏病变，均可通过雷帕霉素抑制mTORC1而得到显著改善，证实了表型依赖于mTORC1的过度激活。
本研究主要应用了以下关键技术方法：利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除/过表达的细胞系和肝特异性基因修饰小鼠模型；通过蛋白质印迹（Western Blot）、免疫荧光（IF）和免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白质表达、定位和相互作用；采用溶酶体分离技术探究蛋白质的亚细胞定位；利用体外重构的巨型单层囊泡（GUV）系统和体外相分离实验，在接近生理的条件下验证IRTKS的膜结合和相分离能力；并利用Lepob/ob小鼠模型进行AAV介导的基因治疗功能验证。
IRTKS激活mTORC1信号
研究证实IRTKS是mTORC1信号通路的一个保守激活因子。磷酸化抗体芯片及后续验证实验表明，IRTKS过表达特异性增强mTORC1下游底物（如P70S6K、RPS6、4EBP1、TFEB）的磷酸化，而不影响mTOR自身或其复合物mTORC2的活性。基因敲除和回补实验进一步支持了这一结论。
IRTKS定位于溶酶体胞质面
研究发现了IRTKS一个新的亚细胞定位——溶酶体。通过细胞组分分离、免疫荧光共定位及双分子荧光互补（BiFC）等技术，证实IRTKS通过其I-BAR结构域与溶酶体膜蛋白LAMP1的胞质区相互作用，从而定位于溶酶体表面。
溶酶体定位的IRTKS支持mTORC1的游离氨基酸感知
研究发现，游离氨基酸能增强IRTKS与mTORC1组分（mTOR、RPTOR）的相互作用。IRTKS的表达水平正调控mTOR在溶酶体上的招募，从而影响mTORC1对氨基酸刺激的响应速度和作用强度。
IRTKS在溶酶体上发生液-液相分离
研究揭示了IRTKS调控mTORC1的核心机制——液-液相分离。IRTKS通过其IDR区域在溶酶体膜上形成生物分子凝聚体。破坏其相分离能力（如用1,6-己二醇处理或使用P-to-A突变体）会显著削弱其溶酶体定位及mTORC1激活功能。
IRTKS通过形成与RRAGD的凝聚体激活mTORC1
研究发现，IRTKS凝聚体能够特异性富集GTP酶RRAGD。IRTKS作为相分离支架，通过增强RRAGD与mTORC1的结合来放大氨基酸依赖的mTORC1活性。RRAGD的敲低或功能获得性突变均能消除IRTKS对mTORC1的调控作用。
肝特异性Irtks过表达通过mTORC1导致MASLD和相关HCC
动物实验证实，肝细胞中Irtks的过表达通过持续激活mTORC1，驱动小鼠从单纯性脂肪肝（MASLD）向脂肪性肝炎（MASH）乃至肝细胞癌（HCC）的进展。而抑制mTORC1（雷帕霉素）或敲低Irtks均可有效缓解疾病表型。
靶向Irtks可缓解MASLD
最后，研究在疾病模型（Lepob/ob小鼠）中证明，通过AAV病毒载体靶向敲低肝脏Irtks表达，能够有效抑制mTORC1信号，改善肝脏脂肪变性和功能损伤，凸显了IRTKS作为MASLD治疗靶点的潜在价值。
综上所述，本研究首次阐明了IRTKS通过液-液相分离在溶酶体上形成生物分子凝聚体，进而特异性招募并激活mTORC1信号通路的新机制。这条新发现的IRTKS-mTORC1轴在连接营养感知、代谢调控与肝脏疾病进展之间发挥了关键作用。研究不仅深化了对MASLD/HCC发病机制的理解，也为开发针对该信号轴的新型治疗策略提供了重要的理论依据和实验证据。
