程翔楚|范晓宇|黄忠强|赵冉|陈英伟|蔡雪|徐星|胡晓波|王学良
上海临床实验室质量控制材料研发部，中国上海200126
摘要
持续感染低风险人乳头瘤病毒（HPV），尤其是6型基因型，是全球生殖器疣的主要原因之一。准确检测HPV6对于流行病学监测、疫苗评估和临床诊断至关重要，但检测灵敏度和基因型交叉反应性的差异阻碍了实验室间的可比性。为了克服这些限制，我们开发了一种可溯源的HPV6 DNA参考物质（RM）。该参考物质是从含有HPV6基因组的基因编辑细胞系中提取的基因组DNA制备的，并通过数字PCR进行了表征，以确保符合国际单位制（SI）的可追溯性。数字PCR分析证实了其出色的基质互换性、均匀性和稳定性。其赋值为1.02×10³拷贝/μL，扩展不确定度为0.17×10³拷贝/μL。随后我们使用该参考物质评估了三种商业HPV6检测方法，其中两种方法完全达到了其宣称的检测限。临床验证进一步证实了该参考物质的稳定性和适用于常规诊断应用。这种HPV6 DNA参考物质作为一种基质等效的、可溯源的标准物质，有助于检测方法的校准、质量保证和临床性能验证，从而促进HPV分子检测的标准化。
引言
人乳头瘤病毒6型（HPV6）是一种主要的低风险基因型，与生殖器疣和复发性呼吸道乳头瘤病等良性但易复发的疾病相关，这些疾病给患者带来了巨大的身体、心理和医疗负担[1]、[2]。尽管HPV6相关疾病是非恶性的，但其持续性和复发性给公共卫生和社会经济带来了重大挑战[3]。随着HPV DNA检测在疾病预防、疫苗监测和临床管理中的广泛应用，对HPV6 DNA的准确检测和定量需求日益增加[4]、[5]、[6]。目前的HPV6基因分型方法包括定量实时PCR（qPCR）、PCR-反向点印迹杂交、PCR-基因芯片分析、流式荧光杂交和下一代测序[7]、[8]。然而，分析灵敏度、特异性和基因型交叉反应性的差异经常导致实验室间结果不一致[9]、[10]，这凸显了制定标准化参考物质（RM）的迫切需求，以确保检测方法间的可比性和计量可追溯性[11]、[12]、[13]。
虽然市面上有基于质粒的HPV DNA标准品，例如世界卫生组织认可的第一个HPV6 DNA国际标准品（国家生物标准与控制研究所代码：14/256），但其人工结构无法复制人类基因组DNA的构象和基质特性[14]。这些结构差异可能会影响扩增效率并降低临床检测中的互换性。为了克服这些限制，我们首次开发了一种国产的、可溯源的HPV6 DNA参考物质，该参考物质来源于通过PiggyBac转座子系统整合了完整HPV6基因组的基因编辑细胞系[15]、[16]。这种基因整合配置提供了一个生物学上相关且稳定的DNA来源，与天然临床样本非常相似，从而提高了检测方法的稳健性和跨平台一致性[17]。
基于这种基因整合的HPV6 DNA参考物质，我们通过数字PCR（dPCR）对其特性进行了表征，评估了基质效应、均匀性、稳定性并确定了其赋值，并在多种商业HPV6检测系统中对其性能进行了评估[18]、[19]。该参考物质为HPV分子诊断中的定量标准化、方法验证和临床质量保证奠定了基础。
章节片段
HPV6基因编辑细胞系的制备和DNA提取
HPV6基因编辑细胞系由苏州海森生物科技有限公司（中国苏州）使用PiggyBac转座子系统生成，该系统能够实现外源DNA的稳定基因组整合[21]。全长HPV6基因组（7902 bp；NCBI参考序列：NC_00135.1）通过PiggyBac介导的转座整合到宿主基因组中，确保了病毒序列的均匀和稳定整合。HPV6 DNA的质量评估
提取的HPV6 DNA质量很高，浓度为31.25 ng/μL，A260/A280比为1.89，A260/A230比为2.00，表明其适用于后续实验应用（SuM-1 图S1）。Sanger测序显示gDNA与参考HPV6 DNA序列具有100%的同一性，证实了所有分析样本中的稳定整合和遗传稳定性（SuM-2）。这些结果表明，在整个过程中没有引入任何序列变异。结论
在这项研究中，我们建立了一种来自含有整合HPV6基因组的基因编辑细胞系的、可溯源的HPV6 DNA参考物质。这种基因整合配置提供了一个生物学上相关且稳定的DNA来源，与传统基于质粒的标准品相比，在各种核酸检测平台上的基质互换性更好，一致性更高[33]。基质互换性评估证实，该参考物质产生的结果与其他参考物质相当。
CRediT作者贡献声明
程翔楚：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，验证，监督，资源协调，项目管理，方法学设计，研究实施，资金获取，数据分析，数据管理。范晓宇：撰写 – 审稿与编辑。黄忠强：项目管理，方法学设计，研究实施，数据分析，概念构思。赵冉：数据管理。陈英伟：数据管理。蔡雪：验证。徐星：验证。胡晓波：撰写 – 审稿与
资助
本研究得到了上海市公共卫生研究计划（资助编号：2024GKQ13）、上海临床实验室（资助编号：2024RCJH-04）、上海市卫生健康委员会（资助编号：202240270和2024ZZ2011）的支持。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。致谢
我们衷心感谢岳阳中西医结合医院、上海同仁医院、上海凯普医学实验室有限公司、上海交通大学医学院附属崇明医院、上海第十人民医院、上海中科润达医学实验室有限公司和上海金基医学实验室有限公司在HPV6临床验证方面提供的协助。
