ABSTRACT
阿奇霉素被广泛用于治疗沙眼衣原体感染，但该物种对药物的耐药程度尚未明确。本研究调查了1,349个高质量沙眼衣原体基因组中与推定性阿奇霉素耐药相关的突变和替换。与参考菌株D/UW-3/Cx相比，编码三种非同义替换的rplV基因突变被发现是常见的，但在引起流行性泌尿生殖道和肛门直肠感染及性病淋巴肉芽肿(LGV)的系统发育谱系中基本保守。然而，在眼部谱系中未发现这些突变。时间标定的系统发育分析表明，这些突变早于阿奇霉素的临床引入。相比之下，在23S rRNA或rplD基因中未观察到一致的耐药相关模式。这项大规模基因组监测为了解沙眼衣原体推定性阿奇霉素耐药性的进化趋势提供了关键见解，并强调了将基因组监测与表型药敏测试相结合以准确评估和管理抗菌药物耐药性的重要性。
INTRODUCTION
沙眼衣原体是一种专性细胞内病原体，是全球细菌性性传播感染(STIs)最常见的原因。沙眼衣原体的眼部菌株会引起沙眼，这是传染性失明的主要原因，在沙眼流行地区，女性因更多接触作为感染储存库的儿童而风险更高。对于性传播感染，治疗通常涉及抗生素，如多西环素(doxycycline)或单剂量阿奇霉素。最近的临床证据表明，多西环素治疗直肠衣原体感染比阿奇霉素更有效。对于沙眼，局部四环素软膏或口服阿奇霉素历来是首选方案。阿奇霉素是世界卫生组织(WHO) SAFE策略下实施的许多大规模药物管理(MDA)运动中的首选抗生素，旨在消除致盲性沙眼。尽管付出了大规模努力，但消除目标尚未完全实现，一些国家，特别是撒哈拉以南非洲地区，如埃塞俄比亚和苏丹，仍然流行。认识到这些挑战，世卫组织将其全球消除致盲性沙眼的目标从2020年延长至2030年。
阿奇霉素是一种氮杂内酯类(azalide)抗生素，是大环内酯类的一个亚类。它于1980年被发现，1981年获得专利，1991年后由辉瑞公司推出并开始广泛使用。此后，它已成为治疗细菌感染最广泛使用的抗生素之一，包括沙眼衣原体感染，因为它具有广谱活性、组织渗透性和长半衰期以及患者依从性好的优点。然而，其广泛使用也引发了对其潜在耐药性出现的担忧。
几项性传播感染研究报告了阿奇霉素治疗沙眼衣原体失败的情况。这些失败通常归因于初始感染清除后再次感染另一种沙眼衣原体菌株，或初始感染的持续存在。持续性感染通常归因于沙眼衣原体抗生素耐药性的发展。一些研究已确定23S rRNA、rplV和rplD基因的点突变可能与沙眼衣原体的大环内酯类耐药有关。在编码L22蛋白的rplV中，在阿奇霉素治疗失败患者的分离株中检测到导致G52S、R65C和V77A替换的突变，尽管最低抑菌浓度(MICs)在敏感范围内。相同的变异在俄罗斯泌尿生殖道分离株中的大环内酯类耐药和敏感菌株中均有观察到，并在斐比的子宫颈、阴道和直肠样本中发现。对于RplD（L4蛋白），研究报告了P109L、P151A和Q66K替换，而其他研究未在临床分离株中检测到rplD突变。23S rRNA基因突变A2057G、A2058C、A2059G和T2611C与耐药性相关，但其存在和作用在不同研究间不一致。值得注意的是，上述所有23S rRNA突变也列在NCBI参考基因目录中，这是一个公共数据库，汇编了不同病原体中已知的抗菌素耐药性基因和相关突变。同样，综合抗生素耐药性数据库(CARD)是另一个经过整理的资源，详细说明了耐药性决定因素、机制和基于突变的关联。CARD的最新版本特别记录了与沙眼衣原体阿奇霉素耐药相关的23S rRNA突变，而NCBI目录列出了在多种细菌物种中报告的rplD、rplV和23S rRNA突变。
在本研究中，我们分析了来自公共数据库的全球分布的1,349个沙眼衣原体基因组集合中与阿奇霉素耐药相关的23S rRNA基因的DNA突变以及L22和L4中的DNA突变和氨基酸替换。我们的目的是描述推定性阿奇霉素耐药变异的流行率、谱系特异性和进化模式。
RESULTS
推定性耐药突变在rplV基因中具有谱系特异性
我们检查了1,349个高质量沙眼衣原体基因组数据集中的耐药相关突变。核心基因组系统发育将基因组分为四个主要谱系，与先前研究一致：性病淋巴肉芽肿(LGV)、眼部、流行性泌尿生殖道/肛门直肠(P-UA)和非流行性泌尿生殖道/肛门直肠(NP-UA)，反映了它们的疾病趋向性。所有替换都是相对于典型参考D/UW-3/Cx序列（一种NP-UA基因组）进行调用的。
我们首先关注L22中与沙眼衣原体阿奇霉素耐药相关的三个氨基酸替换：G52S、R65C和V77A。在每种情况下，我们发现替换是由单个突变引起的。这些替换显示出强烈的谱系特异性。所有LGV基因组(191/191, 100%)携带G52S和V77A，而几乎所有P-UA基因组(399/404, 98.8%)含有全套三重替换(G52S, R65C, V77A)。相比之下，这些推定性耐药相关替换在眼部基因组(0/450)中完全不存在，在NP-UA基因组(4/304, 1.3%)中罕见。在罕见的含有G52S、R65C和V77A替换的NP-UA基因组中，序列与P-UA等位基因相同，提示通过同源重组发生交换。在罕见的缺少这些突变的P-UA基因组中也观察到相反的模式。
我们接下来扩大了分析范围，以识别数据集中相对于参考D/UW-3/Cx蛋白序列导致氨基酸替换的其他rplV突变。检测到其他13种替换，大多数频率低且限于特定谱系，唯一的例外是Q111R替换，在少数眼部(28/450, 6.2%)和LGV(2/191, 1.0%)基因组中存在。在P-UA谱系中，S86A和K87R在单个基因组中共存，而L22S在另一个基因组中检测到。在眼部基因组中，R17H是最常见的次要变异(86/450, 19.1%)，其次是Q111R(28/450, 6.2%)，其他几种频率非常低(N25D, E30K, E108G, 各≤2个基因组)。在NP-UA基因组中，V29I在26/304(8.5%)中观察到，I63V在4/304(1.3%)中，T99S在单个基因组中。在LGV基因组中，Q111R存在于2/191(1.0%)，而V70I更常见(68/191, 35.8%)；R65H仅出现一次。
总之，这些发现表明推定性阿奇霉素相关的rplV突变紧密聚集在P-UA和LGV谱系中。这些变异在眼部基因组中的缺失可能反映了它们与P-UA和LGV谱系长期以来的进化分离。存在其他替换，但除了Q111R外，没有同塑性证据。在P-UA和NP-UA谱系菌株中也存在基因转换事件的证据。
L22耐药相关替换早于阿奇霉素的广泛临床使用
在1,349个基因组中，有138个(10.2%)具有分离年份的元数据。我们数据集中最新的样本来自2019年。基因组SAMEA767935（P-UA谱系，E/Bour ompA型），收集于1959年，携带所有三个经典的L22耐药相关替换(G52S, R65C, V77A)。另一个1959年的基因组SAMEA1973344（眼部谱系，C/TW-3/OT ompA型）在L22中没有替换。第二古老的基因组SAMEA767923（LGV谱系，L3/404 ompA型），收集于1967年，携带双重突变(G52S和V77A)。在1959年和1967年的基因组中存在耐药相关的rplV突变表明这些突变在1991年后该抗生素广泛临床使用之前就已出现。时间标定的系统发育分析进一步支持了这一观察结果。使用严格分子钟和指数增长种群模型，我们估计携带三重突变的基因组在1,016至1,779年之间分化的可能性为95%，而携带双重突变的基因组在850至1,695年之间分化。
rplD和23S rRNA中的突变模式
先前报道为阿奇霉素耐药相关的三种L4蛋白替换(P109L, P151A, Q66K)在本研究的1,354个沙眼衣原体基因组中未发现。由于rplD基因在细菌物种间序列差异大，NCBI参考基因目录中列出的推定性耐药相关替换均无法在我们的数据集中识别，因为其他物种的蛋白序列与沙眼衣原体L4蛋白无法对齐。在蛋白质内部观察到少量替换，其中大多数是谱系特异性的。值得注意的是，两个同塑性替换——R111Q和V132I——在P-UA基因组中占主导地位(399/404, 98.8%)，尽管它们也出现在少数NP-UA(n=2)、眼部(n=3)和LGV(n=6)基因组中。这些变异在五个P-UA基因组中缺失，在另外三个中部分缺失，两个缺失R111Q，一个缺失V132I。
同样，对23S rRNA序列的检查显示与先前报道的耐药突变没有明显相关性。在NCBI AMR和CARD数据库中先前描述的10个耐药相关位点中，有四个存在于所有菌株中，包括用于比对的参考菌株。这表明这些变异代表固定或高度保守的位点，而不是获得性耐药的标志。在整个数据集中，总共检测到104个额外突变，每个基因组从一到八个突变不等，其中77.8%(81/104)存在于少于1%的基因组中。此外，由于沙眼衣原体携带两个23S rRNA基因拷贝，我们检查了是否存在杂合突变。只有11个完整基因组组装表现出杂合突变，所有这些都很罕见（存在于少于1%的基因组中）。为了更好地理解谱系特异性模式，我们因此可视化了15个最频繁的突变。15个最普遍的突变是非同塑性的且 largely 谱系特异性，来自NP-UA谱系的基因组显示出最多的稀有突变。然而，观察到的突变频率受到使用NP-UA型菌株作为突变调用参考的影响，这意味着所有差异都是相对于该序列计算的。
总的来说，这些观察结果表明，与rplV类似，rplD和23S rRNA的变异很大程度上由谱系和基因组背景决定，并且没有强有力的证据表明最近存在对阿奇霉素耐药性的选择。
rplV、rplD和23S rRNA不在基因组重组热点中
为了研究rplV、rplD或23S rRNA中的耐药相关突变是否通过种内重组产生，我们比较了随机基因组子集的基因特异性系统发育与核心基因组系统发育。在所有比较中（rplV vs 核心树，rplD vs 核心树，23S rRNA vs 核心树），我们观察到强烈的一致性，没有表明水平转移或重组的异常分支模式的证据。全基因组重组分析进一步支持了这一观察结果。这些核糖体基因中的序列均不位于已识别的重组热点内。相比之下，重组事件主要在预期基因座中观察到，例如编码膜蛋白的基因，其中ompA表现出最高密度的重组位点。
DISCUSSION
从基因组序列推断耐药性的许多方法需要与表型相关的突变目录。在此，我们利用1,354个可用的沙眼衣原体基因组，研究了先前表征的、据称与阿奇霉素耐药相关但根据MICs在敏感性或耐药性程度上存在差异的突变的系统发育模式。大型公共基因组数据集的日益可用性为系统探索不同人群中耐药相关突变提供了机会。这种大规模的基因组方法为更好地理解沙眼衣原体的耐药动态提供了一个框架，并为改进监测和临床管理策略奠定了基础。
我们的研究提供了证据，表明推定性阿奇霉素耐药等位基因在1991年后阿奇霉素广泛临床使用之前就已经存在于沙眼衣原体谱系中。这些等位基因的高度谱系特异性表明，它们的持久性更可能反映了中性进化，而不是阿奇霉素使用后获得的耐药性。这些发现与越来越多的工作相一致，这些工作表明抗菌素耐药性的遗传基础通常早于人类抗生素的使用，古老的选择压力塑造了现代耐药性出现的基因组背景。然而，这些突变可能不直接与阿奇霉素耐药性升高相关。可能，其他小组发现的与rplV相关的推定性耐药表型与附加因素有关，例如上位性突变。尽管如此，这些发现强调了在解释沙眼衣原体抗生素耐药性可能出现时考虑历史和谱系特异性变异的重要性。
确定沙眼衣原体的阿奇霉素耐药性因几个因素而复杂化。尽管阿奇霉素治疗失败已被反复报道，但这些事件本质上是多因素的。来自未治疗伴侣的再感染、药物治疗不足或用药不依从是常见的混杂因素，可以模拟耐药相关的持续性。此外，耐药等位基因的基因型证据虽然提供了有价值的见解，但不能直接等同于耐药表型。一些较早的研究强调了这种脱节，其中观察到治疗失败与耐药相关突变没有明确联系，这强调了耐药性作为一种性状的复杂性。这些观察结果强化了这样一种观点，即沙眼衣原体的耐药性是一种多因素性状，可能受到上位性突变、表观遗传调控、宿主-病原体相互作用或其他尚未表征的机制的贡献。
我们的分析也强调了跨物种转移耐药性标志物的局限性。公共耐药数据库中注释的变异，通常基于其他病原体整理，并不能一致地预测沙眼衣原体的耐药性。例如，23S rRNA中的大环内酯类耐药突变（如A2059G, A2074G, C2611T）在淋病奈瑟菌、大肠弯曲菌和大肠杆菌中已明确建立，但在沙眼衣原体中未显示与耐药性一致相关。事实上，我们在数据集中几乎所有基因组中都发现了这些突变，表明它们可能反映了自然变异而非耐药性。这种相关性的缺乏突出了耐药标志物在物种间的不可转移性。相反，沙眼衣原体中23S变异似乎更紧密地跟踪系统发育背景而非耐药性，这强调了对生物体特异性监测的需求。
推进沙眼衣原体抗菌素耐药性研究的一个主要挑战在于缺乏表型确认。由于其专性细胞内复制，传统的基于培养的MIC测试技术难度大、劳动强度高，并且很少在常规实验室中进行。对有限表型数据的依赖限制了我们大规模验证耐药突变的能力。尽管如此，深入的基因组分析（如我们的研究）对于优先考虑候选等位基因和选择功能研究样本至关重要。通过细化目标库，这些研究为更有效地设计表型测定提供了一个框架，最终弥合基因型监测与临床相关性之间的差距。
综上所述，我们的发现强化了几个关键信息。首先，沙眼衣原体中的耐药相关等位基因是由谱系特异性进化塑造的，并且可能早于阿奇霉素的临床使用。其次，不能假定在源自其他病原体的公共数据库中注释为耐药标志物的突变适用于沙眼衣原体。第三，虽然大规模基因组调查为推定性耐药突变的进化背景提供了宝贵的见解，但它们本身无法确定临床相关性。通过表型MIC测试和实验工作进行功能验证仍然至关重要。展望未来，将基因组监测与表型证据相结合，将是解决沙眼衣原体遗传变异与抗菌素耐药性之间复杂关系的关键，确保耐药性监测和治疗策略既准确又针对该病原体的独特生物学特性。
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