坦桑尼亚姆万扎产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌的基因组流行病学研究：高风险克隆ST131与新兴ST2390的传播与耐药机制解析

本研究针对坦桑尼亚姆万扎地区由产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌（ESBL-EC）和肺炎克雷伯菌（ESBL-KP）引起的感染，开展了深入的基因组流行病学调查。研究人员通过全基因组测序技术，揭示了高风险的ESBL-EC ST131克隆和首次在该地区报道的ESBL-KP ST2390克隆的流行、耐药基因分布（如blaCTX-M-15的主导地位）及其在医院内（尤其是新生儿科）的克隆传播，强调了在资源有限地区加强感染控制和基因组监测的紧迫性。

在坦桑尼亚的医疗环境中，由产超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum Beta-Lactamase, ESBL）的细菌，特别是大肠埃希菌（Escherichia coli, E. coli）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae）引起的感染，正构成日益严重的临床威胁。这些耐药病原体是导致血流感染（Bloodstream Infections, BSIs）、尿路感染（Urinary Tract Infections, UTIs）和皮肤软组织感染（Skin and Soft Tissue Infections, SSTIs）等危及生命疾病的主要原因。在全球范围内，2019年的一项研究估计，近929,000例死亡与耐药性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌相关，而撒哈拉以南非洲国家的死亡率显著更高。世界卫生组织（World Health Organization, WHO）已将对第三代头孢菌素耐药的肠杆菌目细菌（包括ESBL-EC和ESBL-KP）列入其全球抗菌素耐药性行动计划（Global Action Plan on AMR）和细菌优先病原体清单（2017年和2024年）。尽管包括坦桑尼亚在内的中低收入国家（Low- and Middle-Income Countries, LMICs）已采纳了国家抗菌素耐药性行动计划（National Action Plans on AMR, NAP-AMR），但基因组抗菌素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）监测数据的短缺问题依然存在，这阻碍了有效的感染预防与控制（Infection Prevention and Control, IPC）工作。特别是在坦桑尼亚等资源有限的地区，对当地流行的克隆、耐药机制和传播动态的了解仍然不足，这限制了对AMR流行病学的全面理解，并阻碍了针对性公共卫生干预措施的制定。

为了填补这一知识空白，由Vitus Silago、Benson R. Kidenya、Katarina Oravcova、Louise Matthews、Conjester I. Mtemisika、Stephen E. Mshana、Heike Claus和Jeremiah Seni组成的研究团队，在《Journal of Global Antimicrobial Resistance》上发表了一项研究，旨在利用全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）技术，深入刻画在坦桑尼亚姆万扎Bugando医疗中心（Bugando Medical Centre, BMC）引起BSIs、UTIs和SSTIs的ESBL-EC和ESBL-KP分离株的基因组流行病学特征。该研究试图通过全面分析ESBL-EC和ESBL-KP的基因组多样性、耐药决定因子、毒力因子和克隆关系，为资源有限医疗环境中的针对性监测和IPC策略提供见解。

本研究采用了一项基于医院的横断面研究设计。研究人员对从2019年6月至2020年6月以及2023年3月至7月期间，在BMC就诊或住院的患者的血液、尿液和脓液样本中分离出的ESBL-EC（n=39）和ESBL-KP（n=49）进行了全基因组测序。这些菌株均被分类为多重耐药革兰阴性菌（Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacteria, MRGN）水平≥3（即对三个或更多不同抗菌药物类别中的至少一种药物耐药）。研究的关键技术方法包括：1) 细菌分离与常规抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Testing, AST），使用VITEK 2系统并依据EUCAST 2023指南判读；2) 全基因组测序，使用Illumina NextSeq平台进行；3) 生物信息学分析，利用Ridom SeqSphere+、Center for Genomic Epidemiology (CGE)的工具（如ResFinder, PlasmidFinder, VirulenceFinder, SeroTypeFinder）以及Kleborate、ClermonTyping等，进行多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST）、质粒复制子、耐药基因（Antimicrobial Resistance Genes, ARGs）、毒力因子（Virulence Factors, VFs）和系统发育分析；4) 基于核心基因组多位点序列分型（core genome Multilocus Sequence Typing, cgMLST）构建邻接法（Neighbor-Joining, NJ）系统发育树，以识别克隆集群（定义为≤10个cgMLST等位基因差异）。

3.1. 测序菌株的特征

共对88株ESBL阳性菌株（39株ESBL-EC，49株ESBL-KP）进行了测序。这些菌株主要来自住院患者（96.6%），中位年龄为9.5岁。样本主要来源为血液（43.2%），且多数（34.1%）来自新生儿科住院患者。

3.2. 序列类型、血清型和质粒复制子

在ESBL-EC中鉴定出13种序列类型（Sequence Types, STs），优势ST为ST131（30.7%）和ST648（28.2%）。主要血清型为O25:H4（27.0%）和O102:H6（18.9%）。最常见的质粒复制子为IncFII（63.9%）、IncFIB（50.0%）和IncFIA（38.9%）。

在ESBL-KP中鉴定出15种STs，优势ST为ST2390（24.5%，本研究首次在坦桑尼亚报道）和ST17（18.4%）。主要血清型为O1ab:K16（26.7%）。所有ESBL-KP均检出质粒复制子，最常见为IncFII（83.7%）、IncFIB（79.6%）和IncR（36.7%）。质粒复制子repB为ESBL-KP所特有，且存在于所有ST2390菌株中。

3.3. 表型抗菌药物耐药模式

除美罗培南（所有菌株均敏感）外，ESBL-PE对多数测试抗菌药物表现出高耐药率（>50%）。ESBL-EC对环丙沙星的耐药率显著高于ESBL-KP（87.2% vs. 53.1%, p<0.01），而ESBL-KP对庆大霉素（97.9% vs. 71.8%, p<0.01）和哌拉西林-他唑巴坦（67.3% vs. 28.2%, p<0.01）的耐药率显著更高。

3.4. ESBL-EC和ESBL-KP中的AMR基因组决定因子

bla_CTX-M-15是ESBL-EC（87.2%）和ESBL-KP（95.9%）中3GCs耐药的主要决定因子。两菌种在其他ARGs分布上存在差异，例如，氨基糖苷类耐药中，ESBL-EC以aac(6')-Ib-cr（61.5%）为主，而ESBL-KP以aac(3)-IIa（67.3%）为主。磷霉素耐药基因fosA（36.7%）和利福霉素耐药基因arr-3（30.6%）仅在ESBL-KP中检测到。有5株ESBL-EC在ResFinder中未检出3GCs耐药基因，但通过耐药基因标识符（Resistance Gene Identifier, RGI）分析揭示了AmpC β-内酰胺酶基因的存在。

3.5. ESBL-EC和ESBL-KP中毒力因子的基因组决定因子

ESBL-EC携带的毒力基因功能多样，涉及粘附定植、荚膜生物膜形成、侵袭胞内存活、免疫逃逸血清抵抗、铁获取系统、毒素产生及抗菌活性生存等七大类。最常见基因包括fimH（89.7%, 粘附）、fyuA（82.1%, 铁获取）、hlyA/E/F（74.4%, 毒素）等。

ESBL-KP的毒力基因谱相对集中，主要涉及粘附定植（fim、mrk基因簇，100%）、荚膜形成免疫逃逸（acr、rcs基因，100%）和铁获取系统（ent、fep、fes、iroE基因，100%）。所有ESBL-KP ST2390菌株均携带ent、fep、fes、iroE等铁获取基因。根据Kleborate评分，61.2%的ESBL-KP毒力得分为1。

3.6. ESBL-PE的系统发育分析

基于cgMLST的NJ系统发育树分析显示，ESBL-EC存在显著的遗传多样性，并识别出多个克隆集群。高风险的ESBL-EC ST131克隆（血清型O25:H4）在医学病房和新生儿科形成集群传播。ESBL-EC ST648（血清型O102:H6和O153:H6）则在医学、外科和儿科病房形成集群。

ESBL-KP同样显示出高遗传多样性，形成六个主要分支（Clades）和多个克隆集群。新发现的ESBL-KP ST2390克隆（血清型O1ab:K16）的传播主要集中在新生儿科，表明在该病区存在明显的克隆扩张和潜在院内传播。其他STs（如ST17, ST280, ST14）也在特定病区形成克隆集群。

本研究通过全基因组测序揭示了坦桑尼亚姆万扎地区ESBL-EC和ESBL-KP的复杂基因组流行病学特征。研究首次在该地区报道了ESBL-KP ST2390克隆，并确认了全球高风险克隆ESBL-EC ST131的持续流行。bla_CTX-M-15是主要的ESBL基因。系统发育分析揭示了这些高风险克隆，特别是ESBL-KP ST2390在新生儿科的克隆传播，指出了当前IPC措施可能存在漏洞。ESBL-EC和ESBL-KP在耐药谱和毒力基因分布上存在物种特异性差异。所有菌株对美罗培南保持敏感，这肯定了其作为最后防线药物的价值。这些发现强调了在资源有限的医疗环境中，加强基因组监测、将WGS纳入常规AMR监测、以及实施针对性IPC策略（尤其是在新生儿科等高风险区域）的紧迫性，以遏制高风险ESBL-PE的传播。研究的局限性包括单中心设计、样本量有限以及缺乏环境筛查和患者结局数据。