M. Morozzi|V. Borgonetti|C. Sasia|G. Videtta|S. Calenda|D. Catarzi|F. Varano|V. Colotta|N. Galeotti
佛罗伦萨大学神经科学、心理学、药物研究与儿童健康系（Neurofarba），药理学与毒理学部门，Viale G. Pieraccini 6号，50139佛罗伦萨，意大利
摘要
多发性硬化症（MS）是一种自身免疫性慢性炎症性疾病，主要影响中枢神经系统，其特征是氧化应激、脱髓鞘和神经元损伤。目前的MS治疗方法效果不佳，因此亟需新的治疗方案。腺苷在MS中起着重要作用，因为它通过激活A2A 受体（A2A R）来调节炎症和免疫反应。本研究旨在探讨新型选择性A2A R拮抗剂P400和P625在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的治疗潜力，EAE是MS的主要动物模型。将P400和P625以10 μg/鼠的剂量通过鼻喷雾方式给予小鼠14天后，发现它们能够减轻与慢性MS模型相关的运动障碍（临床评分、旋转棒测试）以及热刺激（热板）和机械刺激（von Frey测试）引起的痛觉过敏症状。用苏木精-伊红（H&E）染色观察脊髓切片中的淋巴细胞浸润情况，发现EAE组中的炎症细胞数量显著增加，而P400和P625处理后这一现象得到明显改善。P400还降低了Iba1蛋白的免疫染色强度，Iba1是小胶质细胞的标志物。进一步通过Luxol Fast Blue（LFB）染色和髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫染色发现，脊髓中的髓鞘有明显损失，但P400和P625处理后部分恢复了髓鞘结构。与未处理的小鼠相比，这两种处理方式均增加了脊髓神经丝H（NfH）和GAP43蛋白的表达。这些数据表明，新型选择性A2A R拮抗剂通过抑制神经炎症和脱髓鞘作用，能够有效缓解EAE症状。这些发现进一步强调了A2A R阻断作为控制MS患者神经功能障碍的潜在疗法的重要性。
引言
多发性硬化症（MS）是一种慢性炎症性疾病，全球约有280万人患病，尤其在西方国家发病率较高（Lane等人，2022年），给社会经济带来了巨大影响。MS的特点是免疫系统过度活跃、淋巴细胞浸润、炎症反应、反应性胶质增生、脱髓鞘以及轴突丢失，导致患者出现运动障碍、躯体感觉和视觉缺陷、疲劳、疼痛以及认知功能障碍（Compston和Coles，2008年；Inojosa等人，2020年；Koch-Henriksen和Magyari，2021年）。自身免疫反应针对髓鞘自身抗原，导致血脑屏障（BBB）和脑脊液屏障（CSF）通透性增加，免疫细胞侵入中枢神经系统（CNS），从而引发神经炎症、脱髓鞘和进行性神经元损伤（Correale等人，2017年）。
在这种情况下，腺苷通路成为MS治疗的潜在靶点。腺苷是一种内源性核苷，在生理和病理条件下均具有免疫调节作用。在生理状态下，细胞外腺苷水平较低，发挥神经保护作用；而在炎症或脑损伤等细胞应激状态下，腺苷水平显著升高，导致神经-胶质失衡，进一步加剧神经元损伤（Antonioli等人，2019年；Haskó等人，2005年；Vincenzi等人，2013年）。腺苷的多种生物学效应源于其受体（A1 、A2A 、A2B 和A3 ）的激活。其中，A2A 受体（A2A R）在中枢神经系统及关键外周免疫细胞中广泛表达，在MS中起着关键作用。研究发现，MS患者的淋巴细胞中A2A 受体表达显著增强（Vincenzi等人，2013年），并且在继发性进展型MS患者的脑白质中A2A 受体上调，其表达水平与病情严重程度正相关（Rissanen等人，2013年）。多项研究表明，A2A 受体是腺苷抗炎作用的主要介导因子（Day等人，2004年；Lau等人，2009年；Odashima等人，2005年）。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）这一MS主要动物模型中，敲除A2A 受体后EAE症状加重（Mills等人，2012年；Yao等人，2012年）。此外，用A2A 受体激动剂CGS21680处理MS患者分离出的淋巴细胞可抑制其增殖和促炎细胞因子的释放（Vincenzi等人，2013年）。然而，在EAE小鼠中调节A2A 受体信号通路可能对免疫和炎症反应产生矛盾影响，从而对疾病发展产生保护或有害作用。在免疫当天给予A2A 受体激动剂CGS21680可减轻EAE症状（Ingwersen等人，2016年）。相反，如果在免疫后11-28天（EAE症状已明确时）使用选择性A2A 受体拮抗剂SCH58261、KW6002或非选择性A2A 受体咖啡因进行阻断，则可防止EAE病理进展（Chen等人，2019a；Wang等人，2014a；Zheng等人，2022a）。在不同时间点给予A2A 受体激动剂后对EAE表型的分析显示，如果在免疫后12天（疾病高峰期）给予CGS21680，反而会加重EAE症状（Ingwersen等人，2016年）。这种矛盾效应的可能解释是A2A 受体信号通路在EAE不同阶段的作用机制不同：免疫后第一周，当促炎反应占主导时，A2A 受体拮抗剂可能通过抑制促炎反应起保护作用；而在随后以脱髓鞘和神经元退化为特征的阶段，其阻断作用可能通过非造血细胞发挥益处（Rajasundaram，2018年）。
目前的MS治疗方法主要依赖抗炎药物或免疫抑制剂，这些方法对复发-缓解型MS患者有效，但对进展型MS的效果有限（Hauser和Cree，2020年）。因此，除了抑制导致神经退化的炎症过程外，还需要新的疗法来应对MS的慢性神经退行性变化。鉴于A2A 受体阻断在EAE后期具有潜在的神经保护作用，我们的研究团队进一步探讨了A2A 受体拮抗剂作为MS治疗手段的可行性。为此，我们通过体外和体内实验评估了两种选择性A2A 受体拮抗剂P400和P625在MOG诱导的EAE模型中的疗效。
MOG35-55 EAE模型是在C57BL/6雌性小鼠（体重20-25克，6-10周龄）中建立的，这些小鼠购自Envigo（意大利瓦雷泽）。小鼠被饲养在Ce.S.A.L.（佛罗伦萨大学动物实验中心）的饲养设施中，实验开始前5天使用。小鼠被安置在标准笼子中，每笼8只，环境温度维持在23 ± 1°C，光照周期为12小时（早上7点开灯），并提供标准实验室饮食和自由饮水。
通过时间进程实验评估临床评分发现，MOG诱导的EAE小鼠比未免疫小鼠表现出更严重的运动障碍。从免疫后10天（p.i.）到实验结束（第28天p.i.），评分逐渐升高（图2A）。接受A2A 受体拮抗剂治疗的小鼠在所有时间点的评分均有所下降，并在第28天p.i.达到统计学显著性（图2B）。
MS是一种致残性神经退行性疾病，目前缺乏有效的治疗方法。现有的抗炎和免疫调节疗法并不能始终阻止疾病进展，遗憾的是，没有任何药物能够治愈或阻止疾病进展（Ziemssen等人，2016年）。研究表明，为了提高MS治疗效果，应结合使用抗炎、再生和神经保护措施（Feinstein等人，2015年）。
针对MS慢性神经退行性变化的新疗法是治疗MS的重要临床需求。本研究结果表明，高效的选择性A2A 受体拮抗剂P400和P625能够缓解EAE症状，减轻神经炎症和脱髓鞘。随着美国食品药品监督管理局（FDA）批准A2A 受体拮抗剂istradefylline作为帕金森病成年患者的辅助治疗药物，这一发现为进一步研究A2A 受体拮抗剂在MS治疗中的应用提供了依据。
Vittoria Borgonetti： 验证方法、实验设计。
Chiara Sasia： 实验设计、数据分析。
Giacomina Videtta： 实验设计、数据分析。
Sara Calenda： 方法学设计、数据分析、数据管理。
Daniela Catarzi： 数据管理、概念构思。
Flavia Varano： 数据分析、概念构思。
Vittoria Colotta： 撰写、审稿与编辑、方法学协调、资金申请、数据分析、概念构思。
Nicoletta Galeotti： 撰写、审稿与编辑。
本实验方案经佛罗伦萨大学动物护理与研究伦理委员会批准，并获得意大利卫生部许可（336/2022-PR），符合国际法律法规（欧盟议会和理事会2010年9月22日关于科学实验用动物保护的指令2010/63/EU；美国国家研究委员会2011年发布的《实验室动物护理和使用指南》）。
本研究得到了#NEXTGENERATIONEU（NGEU）的资助，以及大学与研究部 （MUR）、国家恢复与韧性计划（NRRP）第4任务第2组（投资编号1.5 - ECS_00000017 – 托斯卡纳健康生态系统（THE，PNRR，第8部分）的支持。此外还获得了CUP B83C22003920001和BANDO CONGIUNTO_UNIFICRF_COLOTTA的资助。
作者声明没有可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
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