Bacillus velezensis HT_B8的基因组揭示了其内生策略及其对葡萄藤可持续性的生物控制潜力

葡萄主 trunk diseases（GTDs）严重威胁葡萄产量和园地寿命，本研究发现从意大利葡萄中分离的Bacillus velezensis HT_B8具有高效定殖和抑制病原菌的潜力，其基因组揭示丰富的抗菌次级代谢产物基因（如bacillaene、difficidin）及植物互作相关基因（如铁载体合成、细胞壁降解酶），为可持续生物防控提供理论依据。

希巴·特拉贝尔西（Hiba Trabelsi）|格迪拉·凯斯（Ghedira Kais）|乌塞马·卡梅西（Oussema Khamessi）|辛达·切内纳乌伊（Synda Chenenaoui）|萨布琳·赫德拉（Sabrine Hdira）|加达·马胡布（Ghada Mahjoub）|里哈布·马胡布（Rihab Mahjoub）|哈桑·泽姆尼（Hassen Zemni）|阿梅尼·本·阿拉亚（Ameni Ben Alaya）|莫赫森·哈纳纳（Mohsen Hanana）|约斯尔·扎乌阿里（Yosr Zaouali）|文森佐·蒙德洛（Vincenzo Mondello）|阿斯玛·本·萨莱姆（Asma Bensalem）|乔克里·梅萨乌德（Chokri Messaoud）|弗洛伦斯·丰坦（Florence Fontaine）|阿斯玛·本·格尼亚-查克鲁恩（Asma Ben Ghnaya-Chakroun）

纳米生物技术实验室LR24ES19，生物系，卡萨布兰卡大学应用科学与技术国家研究所，邮政信箱676，突尼斯塞德克斯1080，突尼斯

摘要

葡萄藤干病（GTDs），包括Botryosphaeria枯萎病，严重降低了全球葡萄产量和葡萄园的寿命。Bacillus velezensis HT_B8是一种从意大利纳布尔的布阿尔古布（Bouargoub）地区种植的Vitis vinifera Muscat品种中分离出的内生细菌，它能有效地定殖在葡萄组织中，并强烈抑制主要的GTD病原体。其草图基因组长度为4,066,534 bp（GC含量45%），编码3,848种蛋白质、84种tRNA和3个rRNA操纵子。基因组分析揭示了多种抗菌次级代谢产物的生物合成基因簇，如bacillaene、difficidin、surfactin和fengycin，以及与植物-微生物相互作用相关的基因，如运动性、生物膜形成、铁载体产生和生长素生物合成。比较基因组学研究发现了可能增强生物控制效果的独特基因，这些基因与体外实验显示的强大抗真菌活性一致。这些结果为HT_B8的生物控制潜力提供了遗传学依据，并支持将其作为管理葡萄藤干病的可持续策略。

引言

葡萄藤干病（GTDs）是全球影响Vitis vinifera的最具破坏性的疾病之一，通过降低产量、加速葡萄藤衰老和缩短葡萄园寿命导致显著的经济损失[1]、[2]。这些疾病对葡萄栽培的可持续性构成了重大威胁，因为受感染的葡萄园通常需要反复干预、重新种植或提前移除植株，从而造成长期的经济和农业后果。据估计，GTDs每年造成的损失超过15亿美元，地中海国家（如突尼斯和意大利）的地区报告显示，十年内葡萄园产量减少了10-25%[3]、[4]。尽管进行了大量研究，但有效的、持久的GTDs控制策略仍然有限，这突显了迫切需要环境可持续的替代传统化学处理的方法。历史上，疾病管理主要依赖于修剪受感染的组织和施用杀菌剂，但这些方法效果有限且引发了环境问题。最近，包括使用内生细菌和根际相关细菌在内的生物策略作为有前景的补充工具出现[1]。

在新兴的生物解决方案中，有益微生物——特别是与植物相关的细菌——因其促进植物健康和抑制植物病原体的能力而受到越来越多的关注。Bacillus velezensis是一种革兰氏阳性、杆状、需氧、能形成内生孢子的细菌，属于Bacillus subtilis物种复合体，该复合体还包括B. subtilis、B. amyloliquefaciens、B. siamensis和B. licheniformis[3]、[4]、[5]。该复合体的成员因其能够与植物建立有益相互作用而被广泛认可，可以促进植物生长、提高对非生物胁迫的耐受性，并保护植物免受多种病原体的侵害[5]、[6]、[7]。

这些对植物有益的效果主要通过产生多种生物活性化合物来实现，包括细菌素、抗真菌脂肽（如iturins和fengycins）和铁载体，这些化合物在植物微生物组中表现出强烈的抗菌和竞争性[6]、[8]、[9]。除了直接拮抗作用外，B. velezensis菌株还通过高效定殖、生物膜形成、养分动员和调节植物防御反应等机制促进植物健康。

由于这些多功能特性，B. velezensis已成为一种有前景且可持续的化学农药替代品，已有几种菌株被商业化用于生物控制剂和植物生长促进剂[7]、[10]。然而，B. velezensis菌株的生物控制效果和生态适应性往往取决于具体菌株，这强调了在功能和基因组水平上对单个分离株进行表征的重要性。

在这种情况下，研究了从意大利Muscat品种的Vitis vinifera木材中分离出的B. velezensis HT_B8作为对抗GTD相关病原体的潜在生物控制剂。栖息在植物内部组织中的内生细菌特别适合用于生物控制应用，因为它们能很好地适应植物环境并提供长期保护。

为了阐明HT_B8的植物有益性和抗菌特性的分子基础，对其进行了草图基因组测序，并与密切相关的B. velezensis菌株进行了比较基因组分析。本研究的主要目标是识别参与生物控制活性、植物定殖和次级代谢产物产生的基因和生物合成途径，以及评估可能有助于适应葡萄藤内生生态位的菌株特异性特征。这种基于基因组的方法为HT_B8的生物技术潜力提供了全面的见解，并支持将其作为管理GTDs的可持续策略。

部分摘录

生物信息

B. velezensis HT_B8是从2023年在突尼斯纳布尔的布阿尔古布（Bouargoub）种植的Vitis vinifera L. cv. Muscat d’Italie品种的木材中分离出来的。为了分离内生细菌，从健康组织和变色组织之间的过渡区切下小木片（5 × 5 × 5毫米），用70%乙醇表面消毒60秒，然后用无菌蒸馏水冲洗三次，并在无菌滤纸上风干。每个样本选取4-5块转移到马铃薯培养基上

HT_B8的表型和生化特征

Bacillus velezensis HT_B8表现出纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和几丁质酶的阳性酶活性，这从菌落周围的透明晕圈可以看出（表2）。该菌株还产生了铁载体和吲哚-3-乙酸（IAA），但在测试的体外条件下未观察到磷酸盐溶解现象。

HT_B8在pH 6–7条件下生长最佳，能耐受高达6%的NaCl浓度。更高的盐度会导致菌落大小减小，表明其具有生理适应性

讨论

葡萄藤干病（GTDs）仍然是全球葡萄栽培面临的主要且日益严重的威胁，导致严重的产量损失、葡萄藤过早衰退和管理成本增加[1]、[2]。控制这些疾病具有挑战性，因为化学处理往往提供不一致的保护效果，并引发环境和监管问题。因此，识别适应葡萄藤生态系统的有效生物控制剂是实现可持续疾病管理的优先事项。

结论

B. velezensis HT_B8的草图基因组揭示了丰富的基因库，这些基因支持抗菌活性、促进植物生长和内生适应。比较基因组学证实了它与参考菌株PD9的密切关系，同时也突出了在次级代谢产物簇和定殖特征方面的菌株特异性，这些特征可能增强其在葡萄藤组织中的持久性和生态适应性。

HT_B8携带

CRediT作者贡献声明

阿梅尼·本·阿拉亚（Ameni Ben Alaya）：撰写 – 审稿与编辑。莫赫森·哈纳纳（Mohsen Hanana）：撰写 – 审稿与编辑。里哈布·马胡布（Rihab Mahjoub）：撰写 – 审稿与编辑。哈桑·泽姆尼（Hassen Zemni）：撰写 – 审稿与编辑。阿斯玛·本·萨莱姆（Asma Bensalem）：撰写 – 审稿与编辑。格迪拉·凯斯（Ghedira Kais）：软件支持。乌塞马·卡梅西（Oussema Khamessi）：软件支持。约斯尔·扎乌阿里（Yosr Zaouali）：撰写 – 审稿与编辑，监督。文森佐·蒙德洛（Vincenzo Mondello）：撰写 – 审稿与编辑。希巴·特拉贝尔西（Hiba Trabelsi）：撰写 – 原初草稿，可视化，验证，软件支持，资源提供，方法论设计，实验实施，形式审查

利益冲突

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

伦理批准

本研究不涉及人类参与者或动物，因此不需要伦理批准。

资助

本研究得到了卡萨布兰卡大学的支持，提供了让我能够在兰斯进行研究的奖学金。

利益冲突声明

☒ 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

细菌菌株的测序得到了GetGenome和The Sainsbury Laboratory（英国诺里奇）的支持，该机构由Gatsby慈善基金会和生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC）资助；与RIBP UMR INRAE相关的实验得到了Grand Reims和URCA。