微环境相关因素，如粘度、极性、缺氧、pH值和温度等，与亚细胞区室、细胞功能和生物体稳态密切相关[1]。其中，粘度作为细胞内微环境的一个重要参数，在许多生命过程中起着重要作用，例如物质的运输和扩散、生物分子之间的相互作用、化学信号的传递以及电子转移[2],[3],[4]。同时，极性也是活细胞微环境中的另一个重要参数。局部细胞极性的变化可以改变细胞膜组分的通透性，蛋白质也可以发生构象变化以调节其内部极性，从而控制酶反应速率[5],[6],[7],[8],[9],[10],[11]。粘度和极性的异常变化与许多生理功能障碍密切相关，并被认为是某些疾病（包括神经退行性疾病、炎症、心血管疾病、糖尿病和癌症）发生的标志[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18]。粘度和极性的异常与细胞和亚细胞器官的功能障碍有关。亚细胞器官的不同组成导致了细胞内微环境中粘度和极性的异质性。例如，正常亚细胞器官的粘度约为50 cP；而受损器官的粘度可高达100 cP[19]。因此，需要开发检测工具来准确监测特定亚细胞器官中的粘度和极性变化。
线粒体是细胞中一种结构独特且生物成分复杂的器官[20]。作为“细胞能量站”，线粒体通过产生活性氧化物种（ROS）为细胞提供能量，在信号转导[21]、功能调节以及维持细胞正常生理功能中发挥关键作用。过氧亚硝酸盐（ONOO-）作为一种活性氧化物种，是通过超氧阴离子（O2•-）与一氧化氮（NO）的相互作用形成的[22],[23]。ONOO-具有强氧化和硝化作用，参与信号转导并维持线粒体和细胞功能[24]。ONOO-水平的升高可能对DNA、RNA、蛋白质和脂质甚至线粒体造成损伤，导致细胞坏死和凋亡[25],[26],[27],[28],[29]。一旦线粒体功能失调，突变可能导致粘度和极性的变化，从而引发包括糖尿病、心脏病、衰老、帕金森病和脂肪肝在内的多种疾病[30],[31],[32],[33],[34],[35],[36]。因此，迫切需要开发实时检测工具来可视化线粒体的粘度和极性以及ONOO-水平，以探索疾病的病理机制。
基于良好的灵敏度和选择性、实时检测和高分辨率，以及体外和体内的生物成像能力，荧光探针检测受到了广泛关注。已经有一些探针能够独立检测粘度[37]、极性[38]或ONOO-[39],[40]。然而，由于这些探针的光学性质和细胞内分布不同，它们难以在同一细胞区室内实现多分析物成像。尽管已经开发出了用于成像粘度和极性[41]、ONOO-和粘度的荧光探针[42]、ONOO-和极性的荧光探针[42]，但同时测量粘度、ONOO-和极性仍然是一个巨大的挑战。迄今为止，董团队报道了一种基于D-π-A分子系统的探针，可以靶向线粒体。利用激发态分子内电荷转移（ESICT）机制，该探针可以在两个通道中成像ONOO-、极性和粘度[43]。他们同时设计并合成了多功能探针MQA-P，通过扭曲分子内电荷转移（TICT）和分子内电荷转移（ICT）机制来检测ONOO-、极性和粘度，由于光谱重叠，粘度和极性的信号在同一红色通道中收集[44]。邓团队报道了探针VPH-5DF，可以利用双NIR通道策略检测H₂O₂、粘度和极性[45]。同样，刘团队报道了探针DQ-CF₃，可以通过两个发射通道检测O2·-、极性和粘度[46]。此外，我们团队还报道了探针XBL，它能够在线粒体中监测粘度、极性和ONOO-，并可用于细胞和体内的生物成像应用[47]。然而，不幸的是，这些工作仍然面临一个问题，即通过荧光增强和衰减在一个通道中检测到两种物质，这给实际应用带来了很大不便。因此，迫切需要进一步开发能够通过三个通道同时检测线粒体中的ONOO-、极性和粘度的探针，为探索疾病的病理生理机制提供实用手段。
在这里，我们报道了一种荧光探针（VNP-M），它具有三种不同的激活模式，可以响应线粒体的粘度、ONOO-和极性，这是通过三种不同的信号输出机制实现的：（1）通过与ONOO-反应释放的荧光团在约580 nm处产生专用的发射；（2）通过分子旋转受限在约680 nm处产生明显的荧光增强，从而独立检测粘度；（3）通过分析ONOO-反应后释放的产物的光谱形状（表现为曲线下面积（AUC）比率，定量极性。这种单分子/三种模式的策略完全消除了信号串扰，允许探索三种分析物之间的动态相互作用。同时，荧光变化机制通过理论计算得到了进一步详细阐述。该探针在细胞和体内实验中表现出优异的生物成像能力（图1），为通过三通道同时测量线粒体中的粘度、ONOO-和极性，探索疾病状态和进程提供了潜在工具。
