首次记录并详细描述了1969年Penchaszadeh发现的Dicyema platycephalum（属于Dicyemida科：Dicyemidae）在巴塔哥尼亚北部（西南大西洋海域）的Tehuelchus章鱼体内的存在情况

圆盘虫属（Dicyema platycephalum）在阿根廷巴塔哥尼亚海域宿主头足类（Octopus tehuelchus）中的感染模式及分子系统学分析，结合组织学切片、扫描电镜及18S rDNA序列分析，揭示了该物种独特的盘状顶盖结构（十细胞配置）及宿主肾脏组织的病理影响，实验感染失败提示传播机制存在未知环节，分子数据确认其系统分类。

Nuria Vázquez | Gustavo Mariluan | Pablo E. Penchaszadeh | Silvina Van der Molen | Nicolás Ortíz | Eunji Park | Brian Leander | Florencia Cremonte

海洋生物研究所（IBIOMAR）（CONICET-CENPAT联合项目）（U9120ACF），阿根廷马德林港

摘要

双囊虫（Dicyemids）是一类高度特化的寄生虫，主要寄生于大多数头足类动物的肾囊中。本研究通过分析来自巴塔哥尼亚海岸的Octopus tehuelchus标本，进一步详细描述了Dicyemaplatycephalum这一物种。研究采用了组织切片、扫描电子显微镜观察以及18S rDNA序列的分子系统发育分析方法。该物种的特征是具有由10个细胞（4+4+2排列）构成的盘状帽状结构，这一特征在该属中具有典型性。组织学观察显示，除非感染严重，否则肾上皮组织未出现明显损伤；但在严重感染情况下，可观察到上皮褶皱变形和肾小管阻塞现象。扫描电子显微镜图像显示，双囊虫的帽状结构嵌入宿主组织的肾隐窝中。关于双囊虫的许多生物学特性仍不明确，例如其幼虫如何寻找并感染新宿主。尽管尝试使用三种不同的暴露方法对人工饲养的未感染幼年章鱼进行感染，但均未成功。尽管如此，本研究仍利用分子系统发育数据丰富了Dicyemaplatycephalum在南半球的分类描述，并有助于理解双囊虫与其头足类宿主之间的相互关系。

引言

双囊虫是章鱼、鱿鱼和墨鱼肾囊中的常见内寄生虫（Furuya & Tsuneki, 2003; Kobayashi et al., 2009, Souidenne et al., 2016）。头足类的肾附属器官为双囊虫提供了营养丰富的生存环境，其密度可高达每立方厘米数千个个体（Finn et al., 2005, Suzuki et al., 2010）。虽然某些头足类物种体内可同时存在多种双囊虫物种（Furuya & Tsuneki, 2003），但以往认为这些寄生虫具有高度的宿主特异性。不同双囊虫物种之间的宿主特异性存在差异。为深入理解双囊虫与头足类之间的宿主关系，亟需开展宿主物种的分布调查及双囊虫的详细分类研究。然而，最新基于分子系统发育数据（如18S rDNA序列）的研究表明，同一物种内部存在显著的形态变异（Eshragh & Leander, 2014），因此基于形态特征的现有分类鉴定需重新验证。此外，双囊虫在动物进化树中的位置及其总体多样性仍知之甚少，部分原因在于当前的物种划分标准主要基于形态特征。由于寄生虫的形态特征往往缺乏一致性，且其形态变化受发育阶段和环境条件影响（Eshragh & Leander, 2014），因此对其多样性的研究尤为复杂。

双囊虫因其生命周期分为无性阶段和有性阶段而得名：无性阶段由称为“nematogens”的蠕虫状成虫组成；有性阶段中，另一种蠕虫状生物（称为“rhombogens”）会产生多个滴虫状幼虫。滴虫状幼虫在形态上与蠕虫状幼虫不同（体积更小且能自由游动），并可随排泄物离开成虫宿主体内（Furuya & Tsuneki, 2003）。滴虫状幼虫比蠕虫状幼虫更为成熟（Furuya et al., 1997, 2004; Furuya, 1999），呈滴状，由37–39个细胞构成，内部包含4个较大的细胞（称为urn细胞，每个细胞含有一个生殖细胞，Suzuki et al., 2010）。目前尚不清楚幼虫离开宿主后的去向、是否存在中间宿主，以及新宿主是如何被感染的。据推测，滴虫状幼虫在新的宿主体内会发育为蠕虫状幼虫，但双囊虫与宿主之间的具体关系尚未明确。Lapan（1975）认为双囊虫有助于宿主排出氨，因此具有对宿主有益的共生作用；而Ridley（1968）则通过电子显微镜观察发现双囊虫会损害宿主肾附属器官的微绒毛结构，认为其具有轻微致病性。

目前已有9个属被确认，包含约150个有效物种（Catalano, 2013a; Furuya & Moritaki, 2022）。这些生物主要分布于北半球，最初在太平洋西部和东北部、印度洋北部、地中海、大西洋西北部和东部以及墨西哥湾有相关记录（Short, 1991, Furuya, 2006）。南半球方面，Finn et al.（2005）对澳大利亚水域的双囊虫进行了全面调查，发现了部分先前未记录的宿主及新物种。随后Catalano & Furuya（2013）及Catalano等人（2013a, 2013b）又新增了10个物种。此外，Catalano等人（2014）将双囊虫的感染模式与其宿主的生物学和生态学特征（如体型和栖息地）联系起来，特别是多物种共存时的情况。直到Penchaszadeh（1968）在阿根廷马德普拉塔海域（南纬38°，西经57°）发现双囊虫，人们才意识到它们也存在于南半球。在阿根廷水域已鉴定出三种双囊虫：Dicyema australis、Dicyemaplatycephalum和Conocyema marplatensis，它们寄生于体重不超过150克的Octopus tehuelchus（Orbigny, 1835）。这些物种的描述需结合分子系统发育数据和超微结构信息进一步完善。Octopus tehuelchus为南大西洋特有物种，分布于巴西东南部（南纬16°）至阿根廷圣豪尔赫湾（南纬44°）（Ré, 1998）。该物种是巴塔哥尼亚北部海域小型近海渔业的重要资源（Ortiz & Ré, 2014）。

本研究旨在利用分子系统发育数据、组织学和超微结构信息，补充对Dicyemaplatycephalum在Octopus tehuelchus中的描述，并通过三种实验方法（滴虫状幼虫暴露、共栖实验和自然感染）探讨其可能的感染途径。

章鱼采集

2017年6月至2018年5月期间，我们在阿根廷巴塔哥尼亚地区的努埃沃湾（Punta Arco，南纬42°49′，西经61°04′）使用装有PVC陷阱的钓线（模拟人工庇护所）在10米深度处采集了Octopus tehuelchus标本（体重10–79克）。同时，还在圣何塞湾（南纬42°25′，西经64°37′）和马加纳海滩（位于阿根廷海域，南纬43°22′，西经65°02′）的潮间带手工采集了该物种标本。

光学显微镜观察

采集的标本被制成玻片，在光学显微镜（Leica DM2500）下观察，并使用Leica DFC 280数码相机及Leica Application Suite软件进行测量。标本的形态特征与Penchaszah（1969）对D. platycephalum的原始描述一致。本文中使用的细胞类型及生命周期各阶段的名称依据Hochberg（1990）、Furuya和Tsuneki（2003）的研究成果确定。

组织病理学

肾附属器官的组织样本用Davidson固定液固定24小时后，采用常规组织学方法处理。每个样本取5毫米厚的切片，包埋于石蜡中，切成5微米厚的薄片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。组织切片在光学显微镜（Leica DM 2500）下进行观察。

人工饲养幼年章鱼

由于所有采集的野生章鱼均被感染（详见结果部分），因此只能通过人工饲养来获得未感染的个体。为探讨新的感染途径，我们进行了三项实验：“滴虫状幼虫暴露”、“共栖实验”和“自然感染”实验。2022年5月获取了野生Octopus tehuelchus的卵块用于实验。

DNA扩增与系统发育分析

本研究汇编了用于分子系统发育分析的18S rDNA序列数据集，包括来自我们研究的三个序列、GenBank中已有的所有双囊虫序列以及一些身份不明的代表性序列（如Dicyemidae sp.）。作为外群，选择了正旋虫类Rhophaluraophiocomae。通过Gblocks软件处理模糊序列，最终得到1,174个碱基对的比对结果。所有系统发育分析均基于此数据集进行。

形态学

所有检测的Octopus tehuelchus标本均感染了双囊虫，感染率为100%。感染宿主的肾附属器官涂片显示的双囊虫形态与Penchaszah（1969）在阿根廷马德普拉塔海岸发现的Dicyema platycephalum一致：其身体由18个外围细胞围绕中央轴细胞构成，帽状结构呈扁平盘状（即“盘状”，符合分类标准III型）。

其他说明

Dicyema属包含四种具有18个外围细胞的物种：Dicyema acuticephalum（Nouvel, 1947，日本发现）；Dicyema typus（van Beneden, 1976，欧洲水域发现）；Dicyema bilobum（Couch & Short, 1964）和Dicyema typoides（Short, 1964，均发现于墨西哥湾）。Dicyema acuticephalum的帽状结构呈锥形（Furuya et al., 2003）；Dicyema typoides的帽状结构前端圆钝；Dicyema bilobum的帽状结构较大且明显。

实验感染结果

三项实验中均未检测到双囊虫感染迹象。这一阴性结果通过两种方法得到验证：首先，直接在光学显微镜下观察新鲜肾附属器官，未发现双囊虫阶段；其次，对多个章鱼样本的组织切片进行制备和观察，也未发现寄生虫存在。

分子系统发育分析

分子系统发育分析证实，Octopus tehuelchus中的双囊虫属于Dicyema属（图15）。标记为“DicyA”、“DicyE”和“DicyG”的样本在遗传上高度相似（成对遗传相似度>99.6%），均属于Dicyemaplatycephalum。这些样本来自同一宿主物种，但采集时间不同，地点包括努埃沃湾、圣何塞湾和马加纳海滩。

讨论

本研究利用光学显微镜、扫描电子显微镜和18S rDNA序列的分子系统发育分析，补充了Dicyemaplatycephalum的形态特征。这些数据与Penchaszah（1969）的描述一致。这是首次在阿根廷巴塔哥尼亚北部海岸采集的Octopus tehuelchus中发现D. platycephalum的报道。尽管我们进行了努力，但仍有一些细节需要进一步验证。

未引用文献

Braga, 2022; Furuya and Tsuneki, 2007.

CRediT作者贡献声明

Nuria Vázquez：撰写初稿、方法设计、研究实施、资金争取、概念构思。 Gustavo Mariluan：研究实施。 Pablo E. Penchaszadeh：撰写、审稿与编辑、数据管理。 Silvina Van der Molen：项目管理、方法设计。 Nicolás Ortíz：撰写、审稿与编辑、项目管理、研究实施、概念构思。 Eunji Park：撰写、审稿与编辑、方法设计。 Brian Leander：撰写、审稿与编辑、方法设计、资金争取。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益或个人关系。

致谢

感谢Marcelo Santo提供组织学切片，Norberto de Garín提供扫描电子显微镜照片，Natusha Glasinovich和Julián Pontones协助采样，以及María Eugenia Segade在水族箱工作中的帮助。研究资金由CONICET的PIP项目、ANPCyT（PICT 2020-2120项目及BID贷款）、美国自然历史博物馆的Lerner-Gray海洋研究基金，以及加拿大国家科学与工程研究委员会（NSERC）2019-03986和2025-04268项目提供给BSL团队。