Abbreviations
本文涉及的关键缩写包括：ADAMTS（一种去整合素样和金属蛋白酶）、BAPN（β-氨基丙腈）、BM（基底膜）、BMP-1（骨形态发生蛋白-1）、ECM（细胞外基质）、FAK（黏着斑激酶）、FMT（成纤维细胞向肌成纤维细胞转化）、LOX（赖氨酰氧化酶）、LOXL（LOX样蛋白）、pLOX（LOX前肽）、SRCR（清道夫受体半胱氨酸富集域）。
Introduction
蛋白酶在健康和疾病状态下的细胞外基质（ECM）重塑中扮演着关键角色。蛋白酶主要分为四类：金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。其中，含锌金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶在铜依赖性胺氧化酶家族——赖氨酰氧化酶（LOX）的蛋白水解加工中尤为突出。LOX家族包含五个成员：经典的LOX以及LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4。
LOX家族酶的主要功能是催化胶原蛋白和弹性蛋白上经过翻译后修饰的赖氨酸和羟赖氨酸残基发生氧化脱氨反应，从而形成细胞外共价交联。这种交联对于基质组装、细胞外稳态和组织结构至关重要。在稳态或病理刺激下，细胞持续产生或过度表达LOX亚型，这些亚型经过翻译后修饰后，通过分泌途径被运送到细胞外空间。进入细胞外后，蛋白酶识别特定的蛋白水解位点，水解酰胺键，从而释放出加工后的活性形式。与全长前肽相比，切割后的分子形式不仅被催化加工，具有胺氧化酶活性，还可能具备酶活性以外的额外功能，如细胞信号传导和调控多种病理过程。
尽管LOX家族酶的蛋白水解加工机制已有较多研究，但关于不同蛋白酶在纤维化组织重塑中处理LOX家族的具体机制仍不完全清楚。随着近期针对泛LOX抑制或特异性LOXL2抑制以改善癌症和纤维性疾病的临床试验出现，深入了解不同蛋白酶介导的LOX家族酶活化的重要调控节点，对于开发抗LOX疗法的新途径至关重要。
Proteases and LOX
所有LOX家族酶基本上都会在细胞外被蛋白酶进行蛋白水解切割，这对于LOX亚型的胺氧化酶活性是必需的。蛋白酶作为一种特殊的执行者，能够解锁目标蛋白的功能域或决定其细胞定位，并赋予额外的底物特异性。分泌到ECM中的全长LOX前肽（pLOX）经历蛋白酶驱动的催化切割，产生短小的、加工后的LOX家族酶形式，这些形式能有效地与不溶性基质结合。
两类外切蛋白酶是LOX家族酶细胞外蛋白水解加工的主要介质：金属蛋白酶，如骨形态发生蛋白-1（BMP-1）和ADAMTS2、ADAMTS14；以及丝氨酸蛋白酶，如PACE4和Factor Xa。
金属蛋白酶BMP-1属于BTPs（BMP-1/Tolloid样蛋白酶）家族，在发育和各种病理状况下的ECM组装中至关重要。BMP-1基因的敲除或突变会破坏小鼠的早期发育过程导致致死，或在人类中导致成骨不全症。BMP-1在组织纤维化和基质重塑中起关键作用，用抗BMP-1治疗抑制其活性可显著减轻纤维化。BMP-1也在多种癌症中病理性地过表达，驱动上皮-间质转化（EMT）、血管生成和缺氧通路，与不良临床结果相关。
主要的丝氨酸蛋白酶Factor Xa是一种循环凝血因子，能蛋白水解转化并激活凝血酶，从而促进凝血。然而，近期研究也显示了Factor Xa在炎症性疾病、纤维化和癌症中的细胞内功能。FXa是一种具有促纤维化调节能力的循环蛋白酶，能以组织特异性方式促进平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的活化与增殖。抑制FXa活性已被证明可显著改善肝、心和肾纤维化，表明它是纤维化疾病中潜在的治疗调节靶点。
BMP-1和FXa都表现出高底物特异性，并在pLOXs的特定位点进行切割。因此，随着近期研究广泛评估抗FXa和抗BMP-1治疗在改善纤维化方面的效果，理解这些直接靶向LOXs加工和纤维化的潜在治疗方案的生物化学和机制至关重要。
从结构上看，所有LOX家族酶都有一个保守的C端催化结构域，其N端侧翼是一个可变的前肽结构域和一个信号肽序列。经典的LOX被翻译为前原LOX，具有一个高酸性的前肽序列，而LOXL1则有一个脯氨酸富集的前肽结构域。另外三个成员LOXL2、LOXL3和LOXL4在其前肽结构域中包含四个清道夫受体半胱氨酸富集（SRCR 1–4）重复序列。除了LOXL4，LOX家族蛋白的蛋白水解位点和相关蛋白酶已被确定。加工后的蛋白质在ECM重塑过程中的胶原交联中扮演重要角色。
The Lysyl oxidase family and its role in ECM remodeling through crosslinking
蛋白酶活性是一种进化上保守的调节生物通路和信号传导的机制。LOX和LOX样家族酶对于细胞外基质组分，尤其是胶原的交联至关重要，这是组织纤维化和硬化的主要驱动因素。然而，基质重塑主要由众所周知的蛋白酶启动和控制，这些蛋白酶负责加工LOX和LOXL1-3酶的催化结构域。文献报道，切割后的形式是细胞外环境中，尤其是在纤维化病理过程中发现的主要形式。
该酶家族的创始成员LOX以约50 kDa的潜在糖蛋白（pro-LOX）形式合成，并分泌到细胞外空间，随后成熟为约30 kDa的活性LOX酶。在ECM中，pro-LOX主要被BMP-1加工成活性LOX，BMP-1同时也加工纤维状胶原的C端前肽，这对于ECM胶原的沉积和交联至关重要。LOX氧化性地使赖氨酸或羟赖氨酸残基脱氨，形成交联产物（不成熟的/二价的或成熟的/三价的），从而负责纤维状胶原的交联以及在健康和病理状态下的基质重塑。在转移过程中形成的转移前微环境中，缺氧细胞大量产生LOX以促进转移性肿瘤生长和化疗耐药。LOX在转移前微环境中招募骨髓细胞，并通过交联胶原IV来重塑ECM基底膜（BM），进一步驱动转移。近期研究也显示了LOX在促进成纤维细胞活化、成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（FMT）和细胞分化中的细胞内作用，这些都与组织纤维化和硬化有关。在细胞外环境中，加工后的LOX和LOX前肽（LOX-PP）水平升高，连同LOX本身，能够不依赖于β-氨基丙腈（BAPN）地驱动肺纤维化。这表明酶的细胞外蛋白水解加工在调节ECM重塑中起着关键作用。
LOX家族的其他成员，LOXL亚型1-4，也在基质细胞蛋白的细胞外交联中具有典型作用。在肝纤维发生的所有病因中，LOX和LOXL1的互补过表达和串扰与肌成纤维细胞活化和纤维化进展相关。LOXL1以其通过胶原和弹性蛋白交联在ECM重塑中的关键作用而闻名。然而，LOXL1的交联能力是否取决于其蛋白水解加工尚不清楚。
该家族中第三个被深入研究的成员LOXL2，以约100 kDa的全长蛋白形式合成，并分泌到细胞外基质。一旦分泌，它被蛋白酶加工成多种催化活性形式（约50-63 kDa），具体形式取决于加工酶。LOXL2的细胞外加工增加了其催化活性，并且该加工过程对于胶原交联至关重要。同一研究表明，加工后的LOXL2形式在不溶性胶原IV基质中具有更高的溶解度。LOX和LOXL2也被报道在血管平滑肌细胞中共定位，并且LOXL2的细胞外加工能增加LOX活性。这表明，与LOX类似，加工后的LOXL2在基质合成和重塑中也表现出特定的催化能力。LOXL2长期以来被认为通过EMT、FMT、成纤维细胞活化和增殖在肿瘤进展中促进癌变。在近期研究中，LOXL2被证实能促进成纤维细胞增殖和胶原积累，其分泌水平的加工后LOXL2表明其在癌症发展中具有重要的生物学作用。这导致胶原沉积、交联增加以及转移性微环境的形成。LOXL2在纤维化疾病如肾、肝、心、肺和动脉纤维化中也扮演重要角色。
新近加入的成员LOXL3和LOXL4是LOX家族中了解较少的成员，功能已知有限。酶LOXL3以两种亚型产生：一个约97 kDa的多肽和一个约67 kDa的亚型，称为LOXL3-sv1。两种亚型都产生具有功能活性的LOXL3，对ECM胶原和弹性蛋白具有胺氧化酶活性。LOXL3也已知参与癌症发病机制、EMT、ECM重塑和转移。在近期一项研究中，LOXL3被显示与胃癌的不良病理相关。在肝癌中，报道了LOXL3的细胞内作用，通过易位到线粒体并抑制铁死亡来促进化疗耐药。LOXL3与LOXL2一起被研究在肺纤维化中诱导EMT和FMT。抑制LOXL2和LOXL3均能抑制成纤维细胞活化、增殖、侵袭和EMT。其他病理状况，如格雷夫斯眼病和骨关节炎，也报道了LOXL3的炎症和促纤维化作用。
LOX家族酶的新成员是LOXL4，已知能促进肝、肺和胃癌的转移。LOXL2和LOXL4被研究通过FAK（黏着斑激酶）/Src共享一个常见的外泌体介导通路参与癌症发病机制。然而，LOXL4的细胞外加工作用尚不清楚。
Conserved and unique proteolytic sites in the LOX family as a prime target for specific exoproteases
分泌的LOX和LOX样蛋白经历如BMP-1和ADAMTS等酶的蛋白水解活化。这些蛋白酶识别特定的基序并在确定的位点进行切割。
Processing of LOX and LOXL1
LOX和LOXL1都以酶原或静止形式分泌到细胞外环境中，它们的活化需要蛋白水解切割。这种前肽切割主要由BMP-1介导，哺乳动物Tolloid样1（mTLL-1）或氨肽酶B贡献较小。BMP-1催化人类LOX中的Gly168-Asp169键，去除N端前肽，生成约30 kDa的活性LOX酶（包含C端结构域）和一个约18 kDa的LOX衍生前肽。在小鼠的pro-LOX中，还发现了Arg192和Pro193之间的另一个切割位点，导致成熟LOX亚型（约35 kDa）的释放。基质金属蛋白酶-2已知可以水解pro-LOX的Asn156-Leu157之间的键。原胶原N蛋白酶——ADAMTS2和ADAMTS14，位于BMP1切割位点下游50个氨基酸处，可在Asp218和Pro219之间加工原赖氨酰氧化酶。由BMP-1产生的LOX亚型的N端区域包含几个保守的酪氨酸残基，这些残基在ADAMTS2和ADAMTS14加工的亚型中不存在。其中一些保守的酪氨酸残基经过O-硫酸化的翻译后修饰，并在促进LOX与胶原结合中发挥作用。因此，由ADAMTS2/14产生的LOX亚型显示出比BMP-1衍生亚型更低的胶原结合能力。因此，BMP-1对经典LOX的蛋白水解加工，传统上被认为是促进酶活性的机制，实际上可能调节特定的细胞外基质底物相互作用，而不是催化效率，从而在不改变其催化潜力的前提下细化LOX的功能特异性。
蛋白酶对LOX酶原的蛋白水解加工产生了一个催化活性酶和一个具有独特生物学作用的N端前肽（LOX-PP）。活性LOX形式的抑制不能恢复ras回复成纤维细胞的转化表型，而LOX表达的敲低则恢复了致瘤性，这一发现表明LOX的肿瘤抑制功能存在于其前肽中，而非成熟酶。事实上，LOX-PP（而非活性LOX）可抑制ras依赖性信号传导、锚定非依赖性生长和异种移植肿瘤形成。从机制上讲，一旦被内化，LOX-PP通过与前肢芽纤维母细胞生长因子2（FGF-2）/FGFR1-AKT在前列腺癌细胞中相互作用，以及与Ras–Raf–ERK-β-连环蛋白信号在乳腺癌模型中相互作用，来调节致癌信号网络。它直接干扰HSP70、RAF和CIN85，从而减轻增殖、迁移和侵袭，同时触发凋亡。除了癌症，LOX-PP也在神经系统中发挥生物学效应。LOX-PP阻止NF-κB亚基RelA的核定位，导致微管相关蛋白MAP1B和MAP2的表达减少以及浦肯野细胞生长受损。总的来说，这些发现确立了LOX-PP作为一个多方面的调节因子，可拮抗肿瘤促进信号，同时维持细胞内和细胞外稳态。
与LOX类似，其最接近的旁系同源物LOXL1已被报道经历BMP相关金属蛋白酶的蛋白水解加工。BMP-1已知在前肽区域内的一个特定位点切割LOXL1，即His151-Gly152之间，而ADAMTS14在位于前肽区域内并延伸至催化结构域的前几个残基处有三个不同的切割位点：Ala216-Ala217、Asp292-Pro293和Asp375-Pro376。一个类似的蛋白水解机制差异性地调节LOXL1与胶原的结合。近期一项研究证明，BMP-1和ADAMTS14都能加工LOXL1以产生其成熟形式。然而，这些切割事件的结果不同。BMP-1介导的加工似乎保留了LOXL1与fibulin-5结合的潜力，而ADAMTS14的广泛切割（去除了376位点上游的序列）可能会显著降低这种结合能力。重要的是，虽然该研究确认了成熟LOXL1形式的产生，但并未提供成熟LOXL1与胶原或fibulin-5结合的机制。这些不同的蛋白酶识别位点反映，蛋白水解加工不仅调节催化活性，还微调其与细胞外伙伴（如fibulin-5）的相互作用，从而调节其在基质重塑中的作用。
Processing of LOXL2
赖氨酰氧化酶家族蛋白共享一个高度保守的C端胺氧化酶催化结构域。然而，LOXL2在结构上不同于LOX和LOXL1，其N端包含四个SRCR结构域。这些结构域影响了除BMP-1之外的其他酶的蛋白水解位点的可及性。与LOX和LOXL1不同，即使存在原胶原C蛋白酶增强子1，LOXL2也不会被BMP-1加工，而是经历丝氨酸蛋白酶的切割。
在各种前蛋白转化酶中——包括弗林蛋白酶、PACE4和PCSK5（PC5/6）——尽管PACE4被确定为在第二和第三个SRCR结构域之间的Lys317-Ala318处加工LOXL2的主要蛋白酶，但这需要进一步的实验证据。此外，Factor Xa在另一个不同的位点切割LOXL2，即Arg338-Val339之间。值得注意的是，与LOX不同，LOXL2的蛋白水解切割对于其胺氧化酶活性与其底物胶原IV和原弹性蛋白的体外相互作用并非必需，但当LOXL2浓度≤10 nM时，加工后的LOXL2形式能增强胶原IV的交联。因此，LOXL2的蛋白水解加工位点决定了其底物特异性及其形成的交联性质，突出了其蛋白水解调节的功能重要性。
尽管LOXL2与LOXL3和LOXL4具有大量的序列同源性，但前蛋白转化酶对LOXL2表现出特异性。在LOXL2中，蛋白水解位点周围的残基形成了一个识别基序，定义为–R(P4)–X–R(P2)–K(P1)–，切割发生在P1位置赖氨酸的C端侧。序列比对显示，LOXL3（–G(P4)–X–K(P2)–K(P1)–）和LOXL4（–P(P4)–X–R(P2)–K(P1)–）都保留了P1和P2位置配对的基本残基，这与LOXL2中观察到的情况相同。因此，这些位置不能解释观察到的特异性。相反，详细分析表明，决定因素在于P4位置：LOXL2中存在一个碱性残基，而这在LOXL3和LOXL4中都不存在。
Processing of LOXL3 and LOXL4
与LOX类似，LOXL3很可能也被BMP-1在SRCR结构域的第四个结构域内的CGDD 446-449残基处加工，去除了位于蛋白质N端的所有SRCR结构域，产生一个保留铜结合胺氧化酶特征的35 kDa短形式。然而，BMP-1或其他蛋白酶识别LOXL3蛋白水解位点并进行加工的机制至今尚未建立。
在各种细胞类型中未观察到LOXL4的细胞内或细胞外加工，并且LOXL4的体外酶活性不依赖于SRCR结构域的存在。因此，与其他LOX家族成员不同，LOXL4的运作独立于蛋白水解加工和SRCR结构域介导的调控；这需要进一步研究。
Catalytic activity of proteases
如前一节所讨论，LOX家族蛋白在ECM中被丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶进行蛋白水解加工。丝氨酸蛋白酶和含锌金属蛋白酶的活性是高度保守的。本节讨论BMP-1和Factor Xa分别对LOX和LOXL2蛋白水解位点的催化机制。
Processing of Lysyl oxidase by BMP-1
酶BMP-1属于金属蛋白酶类别。其活性位点含有二价锌离子（Zn2+），与三个组氨酸残基（His92, His96, His102）配位。在所有含锌酶中，活性位点中主要保守的残基是通过咪唑环的Nε原子与Zn2+配位的组氨酸。在其活性形式下，BMP-1中的锌与His92、His96、His102和一个水分子配位，采取四面体几何构型。催化机制的初始步骤涉及通过Glu93侧链羧基基团的氢键相互作用，使锌配位的水分子发生O-H极化。随后，极化的水分子作为亲核试剂，攻击pro-LOX的Gly168和Asp169之间的酰胺键的羰基。由于这种亲核攻击，水分子中的羟基（-OH）与剪切酰胺键的羰基形成键，同时Glu93的羧基被质子化。羰基的氧与Zn2+配位，从而形成四面体中间体。该中间体发生转化，当剪切酰胺键的酰胺氮被Glu93的羧基质子化时，Gly168和Asp169之间的酰胺键被切断。Glu93的羧基与切割后产生的游离胺基形成盐桥相互作用。因此，pro-LOX在ECM中成熟为LOX。
Mechanism of serine protease-mediated processing of LOXL2
先前的研究表明，LOXL2是由丝氨酸蛋白酶而非BMP-1加工的。最近发现，凝血因子和丝氨酸蛋白酶Factor Xa能够加工LOXL2。然而，Factor Xa的反应机制尚未详细理解。鉴于丝氨酸蛋白酶已有明确且保守的催化机制，我们提出Factor Xa通过类似的机制运作。
Factor Xa切割Arg338和Val339之间的酰胺键。反应机制通常分为酰化和脱酰两个阶段。在酰化阶段，丝氨酸的氧作为亲核试剂攻击目标剪切酰胺键的羰基。一个组氨酸残基通过接受丝氨酸的羟基质子来协助丝氨酸进行攻击，该过程通过与邻近谷氨酸残基形成的氢键来稳定。这种亲核攻击产生一个四面体过渡态，其中剪切酰胺键的氧阴离子被邻近丝氨酸和甘氨酸残基的酰胺基（-NH-）稳定。随后，通过组氨酸残基对Val339的质子化，酰胺键被切断，同时组氨酸从催化位点移开。结果，产生了一个称为酰基酶中间体的物质。此时脱酰过程开始。一个水分子移动到组氨酸残基附近使其质子化，随后攻击酰基酶的羰基。来自水分子的OH-亲核试剂的攻击类似于酰化阶段中丝氨酸的攻击，并产生一个四面体过渡态。酶通过排出带有羧基部分的Arg338残基而离开这个状态。因此，酶Factor Xa恢复到其静止状态，同时LOXL2的Arg338-Val339之间的酰胺键被水解。
Conclusions and outlook
蛋白酶在细胞外加工LOX家族酶，使其成熟为对ECM组装必需的形式。然而，在病理条件下，蛋白酶活性增强导致LOX家族成员在ECM中的活性增加，是驱动组织纤维化的主要机制。已有证据表明，金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶主要催化LOX家族的加工。尽管它们属于同一类别（即金属蛋白酶），但BMP-1和ADAMTS2/14识别同一底物LOX的不同蛋白水解位点。LOX和LOXL1具有较高的结构相似性；然而，BMP-1在不同的位点水解酰胺键。ADAMTS14可以在LOXL1的三个不同位点进行水解。此外，BMP-1可以加工LOXL3。与LOX类似，LOXL2为丝氨酸蛋白酶PACE4和Factor Xa提供了不同的蛋白水解位点。LOX家族最新成员LOXL4的功能、蛋白水解位点以及相应的蛋白酶尚未确定。
在此，我们概述了含锌金属蛋白酶BMP-1和丝氨酸蛋白酶Factor Xa分别对LOX和LOXL2的催化机制。然而，文献中缺少这两种蛋白酶的详细机制，该机制应能证明活性位点附近的氨基酸如何将底物引导至活性位点，以及蛋白水解位点的氨基酸与活性位点之间的相互作用。此外，能够识别LOXL1中三个不同位点的ADAMTS以及PACE4的催化机制尚未被探索。深入了解赖氨酰氧化酶进行负责ECM重塑的赖氨酸氧化反应的调控机制（主要由蛋白酶主导）是令人兴奋的，并可能提示其他类别的蛋白酶（天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶）作用于LOX家族的可能性。发现蛋白酶对LOX酶的特定位点反应机制，有可能成为改变交联反应活性的开关，并可能成为新的抗纤维化治疗方案。
