在基因治疗领域，小干扰RNA（siRNA）作为一种能够特异性沉默致病基因的强大工具，为许多难治性疾病带来了希望。然而，将siRNA成功转化为安全有效的治疗药物却面临着诸多挑战。其中，脱靶效应是一个尤为棘手的问题——当siRNA意外地抑制了非目标基因的表达时，不仅会降低治疗效果，还可能引发毒副作用，特别是肝毒性，这严重限制了siRNA药物的临床应用。
为了应对这一挑战，Song及其同事在《Molecular Therapy Nucleic Acids》上发表了一项创新性研究。他们意识到，siRNA的脱靶效应主要源于其反义链5′端种子区（第2-8位核苷酸）与非目标信使RNA（mRNA）的部分互补配对，这种机制类似于microRNA（miRNA）的作用方式。传统的解决方案，如引入解锁核酸（UNA）或（S）-二醇核酸（GNA）等热力学去稳定化修饰，虽然能够减少脱靶效应，但往往以牺牲基因沉默活性为代价。因此，研究团队另辟蹊径，将目光投向了核糖的2′-位点，旨在设计一种既能保持RNA干扰（RNAi）效力，又能最大限度减少脱靶效应的新型修饰策略。
研究人员设计并合成了五种在核糖2′-位点带有不同功能基团（包括甲氧基甲基、氟甲基、N-(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基和N,N-二乙基甲酰氨基等）的核苷酸单体（命名为YK-NUM-101至105）。他们将这些新型单体精准地嵌入到靶向人前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）基因的siRNA反义链的种子区内（第6或第7位），并与传统的2′-O-甲基（2′-OMe）和2′-氟（2′-F）修饰以及作为阳性对照的GNA修饰进行了系统比较。
在技术方法上，本研究综合运用了有机合成化学、生物物理表征、细胞生物学和体内药效/安全性评价等多种手段。关键实验技术包括：1）通过多步化学反应合成2′-修饰的核苷酸磷酰胺单体；2）采用固相合成法制备修饰的寡核苷酸链，并通过高效液相色谱（HPLC）和液质联用（LC-MS）进行纯度和分子量鉴定；3）利用紫外熔解曲线（Tm）测量和圆二色谱（CD）分析修饰siRNA双链的热稳定性和二级结构；4）在Hep3B人肝癌细胞系中通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）评估siRNA对PCSK9 mRNA的沉默效率（IC50）及其对潜在脱靶基因（hDSE、PCYOX1、TRIM65）的影响；5）通过RNA测序（RNA-seq）全面分析差异表达基因（DEGs），以评估转录组水平的脱靶效应；6）在表达人PCSK9的转基因小鼠模型中，通过皮下注射N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联的siRNA，评估其体内降低血清PCSK9、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和总胆固醇（TC）的长期疗效；7）在大鼠模型中通过检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和谷氨酸脱氢酶（GLDH）水平以及肝脏组织病理学检查，评价候选siRNA的肝毒性。
研究结果
单核苷酸和寡核苷酸的合成
研究人员成功合成了五种2′-修饰的吡啶核苷酸磷酰胺单体（YK-NUM-101~105）。通过固相合成法将其掺入寡核苷酸链，获得了高纯度（>90%）的目标序列，产率在85%至95%之间，LC-MS分析确认了分子量与预期一致。
含2′修饰核苷酸的双链热稳定性
将单个2′-修饰核苷酸或GNA掺入siRNA双链后，其熔解温度（Tm）相较于亲本siRNA（siRNA-1）显著降低，ΔTm范围在-18.4°C至-21.5°C之间。其中，2′-N,N-二乙基甲酰氨基修饰（siRNA-6）的去稳定化效应最强（ΔTm= -21.5°C）。GNA修饰（siRNA-7）也导致Tm下降（ΔTm= -12.8°C），但程度弱于2′-修饰。
圆二色谱研究
所有RNA双链，包括修饰后的双链，其圆二色谱均显示出典型的A型构象特征，表明2′-修饰或GNA修饰并未改变双链的整体A型构象，但影响了双链的规整性。
体外RNAi活性
在Hep3B细胞中评估了siRNAs对PCSK9的基因沉默活性。所有测试的siRNA均表现出强大的抑制效果。值得注意的是，含有YK-NUM-103（2′-CH2F修饰）的siRNA-4显示出极高的效力，其IC50值低至0.002 nM，分别是亲本siRNA和GNA修饰siRNA效力的21.5倍和40.5倍。研究还发现，双链的Tm与其沉默效率之间没有显著的线性相关性。
2′-修饰核苷酸减轻脱靶效应
针对三个潜在脱靶基因（hDSE、PCYOX1、TRIM65）的评估表明，所有含2′-修饰的siRNA（siRNA-2~siRNA-6）在减轻脱靶效应方面整体优于亲本siRNA-1。特别是siRNA-4和siRNA-6，在测试的三个基因上均未表现出明显的浓度依赖性抑制，显示出优异的脱靶效应 mitigation 能力，其效果甚至优于GNA修饰的阳性对照siRNA-7。
RNA测序分析
RNA-seq结果显示，siRNA-4和siRNA-6诱导的差异表达基因（DEGs）数量，尤其是种子区相关的DEGs数量，远低于亲本siRNA-1，也低于或与siRNA-7相当，进一步证实了这两种修饰在转录组水平上有效降低了siRNA的脱靶活性。
体内活性
在表达人PCSK9的小鼠模型中，单次皮下注射3 mg/kg的GalNAc-siRNA conjugate后，所有siRNA均能持久抑制血清PCSK9、LDL-C和TC水平（长达35天）。其中，siRNA-4和siRNA-6在整个观察期内表现出优于亲本siRNA-1的抑制效果。
安全性评价
在大鼠中进行的高剂量（30 mg/kg，每周一次，共三次）毒性试验表明，与亲本siRNA-1相比，siRNA-4、siRNA-6以及siRNA-7均未引起血清ALT、AST、GLDH水平的显著升高，且肝脏组织病理学检查显示仅引起轻微至轻微的肝毒性，证实了这些修饰在减轻肝毒性方面的有效性。
结论与意义
本研究成功开发了一种基于2′-核糖修饰的新策略，用于优化siRNA治疗的安全性和有效性。通过将一系列新型2′-功能化修饰的核苷酸嵌入siRNA反义链的种子区，研究人员在保持甚至增强对靶基因PCSK9沉默效力的同时，显著降低了由种子区介导的脱靶效应以及随之而来的肝毒性。
该研究的核心发现在于，特定的2′-修饰（如YK-NUM-103和YK-NUM-105）能够在不破坏siRNA双链A型构象的前提下，通过引入空间位阻和改变局部理化性质，有效削弱反义链种子区与非目标mRNA之间的非特异性结合，从而在转录组水平上大幅减少脱靶基因的沉默。尤为重要的是，这种脱靶效应的减轻并未以牺牲其核心治疗功能为代价。相反，如siRNA-4所展示的，其体内外靶基因沉默活性均显著优于传统修饰的siRNA和GNA修饰的对照。
这项研究的意义重大。首先，它为解决siRNA药物开发中长期存在的脱靶毒性问题提供了一种新颖且有效的化学修饰方案。其次，研究结果表明，通过精细的化学设计，可以同时优化siRNA的效力和安全性，这为开发更安全、更高效的寡核苷酸疗法奠定了坚实的基础。最后，该策略的成功预示着2′-核糖修饰核苷酸在临床前和临床疾病模型的基因沉默研究中具有广阔的应用前景，有望推动更多siRNA药物走向临床，惠及广大患者。
