在大肠杆菌（Escherichia coli）中重新合成薰衣草醇（lavandulol）和薰衣草酰乙酸（lavandulyl acetate）

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在大肠杆菌（Escherichia coli）中重新合成薰衣草醇（lavandulol）和薰衣草酰乙酸（lavandulyl acetate）

时间：2026年1月30日

来源：Journal of Biotechnology

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首次在E. coli中成功构建薰衣草醇及其乙酸酯的从头生物合成途径，通过异源甲羟戊酸途径耦合LPPS酶实现薰衣草醇（42.87 mg/L）的合成，并引入酵母ATF1酶完成乙酰化反应（89.43 mg/L），建立高效原核生产平台。

江苏科技大学环境与化学工程学院，中国江苏省镇江市212003

摘要

薰衣草酚及其醋酸酯——薰衣草酰醋酸酯，是存在于薰衣草精油中的珍贵不规则单萜类化合物，在食品和化妆品行业中有广泛的应用。由于从天然植物资源中提取这些化合物存在局限性，开发可持续的微生物细胞工厂来生产它们具有重要的意义。本文报道了首次在大肠杆菌（Escherichia coli）中从头合成薰衣草酚和薰衣草酰醋酸酯的方法。首先，将异源甲羟戊酸（MVA）途径与薰衣草酰二磷酸合成酶（LPPS）耦合，建立了从甘油开始的生物合成路线。为了解决途径中的瓶颈问题，我们过表达了内源性的dITP/XTP焦磷酸酶RdgB，该酶有效促进了前体薰衣草酰二磷酸（LPP）的脱磷酸化，使薰衣草酚的浓度达到了42.87 mg/L。随后，发现来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的醇酰基转移酶ATF1是酰基化薰衣草酚的最有效酶。通过将ATF1整合到该途径中，并优化宿主菌株和发酵过程，最终实现了89.43 mg/L的薰衣草酰醋酸酯产量。这项研究为高效生物合成高价值不规则单萜类化合物建立了一个有前景的原核平台。

引言

几个世纪以来，薰衣草精油（EO）因其治疗和化妆品用途而受到重视，是香水、药品、食品调味剂和消毒剂中的关键成分（Saeed等人，2023年；Landmann等人，2007年）。然而，从植物来源传统提取薰衣草精油受到产量低、气候变化和土地资源限制的制约，无法满足日益增长的全球需求。因此，迫切需要开发利用工程微生物和可再生原料生产高价值薰衣草成分的可持续生物技术平台（Oseni等人，2024年）。在构成薰衣草精油的萜类化合物中，薰衣草酚及其醋酸酯是定义其独特芳香特性的“不规则”单萜类化合物（Pokajewicz等人，2023年；Pokajewicz等人，2022年）。

从生物合成角度来看，单萜类化合物是由特定的合成酶对10碳焦磷酸前体进行重排得到的（Jiang和Wang，2023年）。在经典途径中，香叶基二磷酸合成酶（GPPS）或壬基二磷酸合成酶（NPPS）催化二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）和异戊烯基二磷酸（IPP）的“头对尾”缩合，分别生成香叶基二磷酸（GPP）或壬基二磷酸（NPP）（Ignea等人，2019年）。相比之下，薰衣草酚的生物合成通过一种独特的“非头对尾”机制进行。薰衣草酰二磷酸合成酶（LPPS）催化两个DMAPP单元的缩合，生成分支的不规则前体薰衣草酰二磷酸（LPP）（Demissie等人，2013年；Liu等人，2016年）。随后，LPP发生脱磷酸化生成薰衣草酚，再经过酰基化形成薰衣草酰醋酸酯（Oseni等人，2024年）。虽然植物中负责LPP水解的磷酸酶（Ppases）尚未被明确鉴定，但在薰衣草属（Lavandula）物种中已经发现了几种能够将薰衣草酚转化为薰衣草酰醋酸酯的醇酰基转移酶（AATs）（Sarker和Mahmoud，2015年；Zhang等人，2024年）。最近，Wang等人在真核宿主酿酒酵母中通过改造甲羟戊酸（MVA）途径并优化LPPS的表达，实现了薰衣草酚的生物合成（Nie等人，2025年）。然而，在原核系统中尚未实现这些不规则单萜类化合物的生产。

大肠杆菌（Escherichia coli）由于其快速生长动力学、遗传背景的明确性以及强大的合成生物学工具的可用性，成为代谢工程的首选底盘（Xu等人，2020年）。尽管在工程化的大肠杆菌中已经实现了香叶醇（Wang等人，2022年）、芳樟醇（Wu等人，2021年）、柠檬烯（Rolf等人，2020年）和沙比利烯（Zhang等人，2014年）等典型单萜类化合物的克级生产，但尚未报道在该公司中从头合成薰衣草酚和薰衣草酰醋酸酯。缺乏针对非经典LPP前体的特定磷酸酶是原核生产中的一个关键瓶颈。

在这项研究中，我们首次对大肠杆菌进行了工程改造，实现了从简单碳源从头合成薰衣草酚和薰衣草酰醋酸酯。我们采用了一种系统的模块化工程策略。首先，将外源MVA途径与LPPS耦合以提供前体。为了解决水解瓶颈问题，我们筛选了一组内源性大肠杆菌Ppases，并鉴定出dITP/XTP焦磷酸酶RdgB作为有效的LPP脱磷酸化酶，显著提高了薰衣草酚的浓度。此外，为了实现酯类产物的有效合成，我们评估了多种异源AATs，并将来自酿酒酵母的高活性ATF1整合到途径中。最后，通过宿主菌株选择和发酵优化，成功建立了一个高效生产这些高价值不规则单萜类化合物的平台。

化学品

薰衣草酚和薰衣草酰醋酸酯购自中国上海的Yuanye Biotech公司。柠檬烯、异戊二烯醇、异戊烯、异戊烯基醋酸酯、戊二烯基醋酸酯、橙花醇、香叶醇、香叶醛、香叶基醋酸酯、法尼醇和法尼醛购自中国上海的Aladdin公司。同源重组试剂盒购自中国南京的Vazyme Biotech公司。其他化学品和试剂盒除非另有说明，均购自中国上海的Sangon公司。

菌株和质粒

所有使用的菌株、质粒和引物

培养基和培养条件

种子培养物在37°C和220 rpm下于2 mL LB培养基中培养过夜。随后，将这些种子培养物接种到14 mL试管中的2 mL 2YT培养基中，培养条件同样为37°C和220 rpm，接种比例为1.5%（v/v）。当细胞在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到0.6至1时，根据特定的诱导系统要求添加IPTG（0.01至0.1 mM）和L-阿拉伯糖（10至50 mM）。此外，加入20%（v/v）十六烷以富集挥发性化合物。

产品定量分析方法

培养液在10,000 × g下离心10分钟后，从十六烷相中回收挥发性产物。然后提取50 μL十六烷相，并与等体积的乙酸乙酯混合。接着，将1 μL稀释样品进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析，使用的是Thermo Fisher Scientific公司生产的ISQ & Trace 1310仪器。分析过程中使用了TG-5MS毛细管柱（内径30 mm，长度0.25 mm，壁厚0.25 μm）。

在大肠杆菌中重建薰衣草酚的生物合成途径

为了在大肠杆菌中重建这一生物合成途径，采用了包含两个功能模块的模块化策略。上游模块是一个外源MVA途径，来源于pJBEI-6409质粒（Addgene #47048），该质粒已被验证可用于高效生产柠檬烯（Alonso-Gutierrez等人，2013年）。具体来说，通过删除香叶基二磷酸合成酶（GPPS）和柠檬烯合成酶，构建了一个新的上游质粒pMVA345。

CRediT作者贡献声明

Kefa Hu：撰写原始草稿、方法学设计、数据管理。Zhipeng Qi：资金获取、概念构思。Shaoheng Tang：监督、项目管理、概念构思。Lei Wang：方法学设计、概念构思。Xiaomeng Zhang：方法学设计、资金获取、概念构思。Xiaode Huang：方法学设计、概念构思。