肿瘤诱导的鸡绒毛尿囊膜中的放射状血管模式

本研究通过鸡绒毛膜模型探究肿瘤诱导的放射状血管模式机制，利用荧光显微、腐蚀铸造等技术分析13种肿瘤细胞系，发现6种形成局部肿瘤并产生放射状血管模式，主要源于内翻性血管生成而非内皮增殖，转录组未发现特异性基因标记，证实内翻性血管生成是放射状血管模式的基础。

Kenji Chamoto | Jennifer M. Pan | Jae Cho | Hassan A. Khalil | Maximilian Ackermann | Steven J. Mentzer

美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆妇女医院适应性与再生生物学实验室

摘要

肿瘤植入鸡的绒毛尿囊膜（CAM）后，会形成一种特征性的放射状或“星爆”微血管模式，这种模式通常被认为是由肿瘤血管生成因子驱动的血管新生过程造成的。在这里，我们利用活体荧光显微镜、粒子追踪、腐蚀铸型、扫描电子显微镜以及转录组分析技术，对13种肿瘤细胞系的这种模式进行了结构和功能研究。其中8种细胞系成功实现了移植；6种细胞系在3天内形成了局部肿瘤团块，并伴有明显的放射状血管结构；而另外2种细胞系则表现出弥漫性生长和广泛的毛细血管增生。功能成像显示，在肿瘤边缘存在优先的血流路径、毛细血管环以及U形轨迹。结构分析表明，放射状血管主要通过内吞作用进行复制和管腔内柱状结构的形成，而不仅仅是内皮细胞的增殖。相比之下，尽管存在明显的毛细血管增生，弥漫性肿瘤却缺乏放射状的组织结构。整体转录组分析未能发现独特的血管生成基因特征。这些发现表明，内吞作用在肿瘤诱导的CAM微血管模式形成中起着关键作用。

引言

大多数实体瘤起源于少数依赖血管外空间可扩散营养物质的细胞。随着肿瘤的发展，越来越多的宿主微血管会出现在肿瘤边缘。这些边缘微血管会形成典型的放射状或“星爆”模式，并汇聚到肿瘤团块上（Ausprunk和Folkman，1977年）。这种新血管生成现象被认为是由一种统称为“肿瘤血管生成因子”（TAF）的生化梯度所驱动的（Folkman，1971年）；然而，这种放射状模式的解剖学特征及其功能意义在很大程度上仍不清楚。

肿瘤诱导的血管生成现象已在多种体内模型中被观察到，包括啮齿动物（Paku等人，2011年）、斑马鱼（Rebelo de Almeida等人，2020年）以及鸡的绒毛尿囊膜（CAM）（Ausprunk等人，1975年）。CAM是一个特别有用的模型，因为它提供了一个方便且成本效益高的体内研究平台来观察肿瘤诱导的血管生成过程。由于其密集且光学可访问的微血管网络，CAM能够支持哺乳动物肿瘤细胞系（Ribatti，2016年）和患者来源的异种移植物的有效移植（Ribatti，2008年）。在CAM肿瘤模型中，经典的放射状星爆血管模式在植入后2至3天内开始形成（Ausprunk等人，1975年），并在植入后3至4天内完全建立（Ausprunk等人，1975年；Knighton等人，1977年）。这些结构变化发生得非常迅速，无法仅用内皮细胞增殖来解释（Ausprunk和Folkman，1977年）。

为了研究肿瘤诱导的微血管模式，我们通过光学显微镜、荧光显微镜以及腐蚀铸型和扫描电子显微镜对13种体外肿瘤进行了观察。虽然几乎所有肿瘤都引发了某种程度的血管新生，但独特的放射状模式依赖于内吞作用引起的血管复制。

实验方法概述

实验材料

实验中使用的无特定病原体的受精白来航鸡卵（Gallus domesticus）来自Charles River Laboratories（美国马萨诸塞州威尔明顿）。所有实验均遵循美国实验动物护理协会（Bethesda，MD）的指导原则进行。实验在鸡免疫系统成熟之前的发育阶段进行（Garcia等人，2021年）。

离体培养

所有实验均采用了改良的离体（无壳）培养方法（Tufan）

肿瘤生长

测试了多种物种的肿瘤细胞系在CAM上的移植和生长能力。有5种细胞系的生长情况不佳（表1）；8种细胞系表现出可重复的生长和新血管形成。在CAM上的成功移植率介于50%到72.7%之间。与先前的研究结果一致（Ausprunk和Folkman，1977年），光学显微镜观察显示肿瘤生长区域附近出现了新血管（图1）。

放射状血管

肿瘤边缘的血管变化...

讨论

在本研究中，我们分析了植入鸡绒毛尿囊膜（CAM）的肿瘤细胞系所形成的放射状微血管模式。在研究的13种肿瘤细胞系中，有8种成功实现了移植；其中6种细胞系形成了局部肿瘤团块，2种细胞系形成了无明确肿瘤团块的弥漫性片状生长模式。这6种局部肿瘤在移植后3天内均形成了放射状或星爆血管模式。

作者贡献声明

Kenji Chamoto：概念构思、数据分析、实验设计。 Jennifer M. Pan：概念构思、数据分析、撰写、审稿与编辑。 Jae Cho：数据管理、数据分析、撰写、审稿与编辑。 Hassan A. Khalil：概念构思、数据分析、方法学设计、撰写、审稿与编辑。 Maximilian Ackermann：实验设计、方法学设计、数据可视化、撰写、审稿与编辑。 Steven J. Mentzer：概念构思、方法学设计、实验监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。