在神经科学领域，遗传性痉挛性截瘫（Hereditary Spastic Paraplegia, HSP）是一组具有高度临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病，其中SPG76是由CAPN1基因突变引起的复杂型HSP。CAPN1基因编码的calpain 1是一种钙激活的半胱氨酸蛋白酶，广泛参与包括突触可塑性、细胞存活与凋亡在内的多种关键细胞过程。有趣的是，与calpain 1高度同源的calpain 2却常常发挥着相反的作用：calpain 1通过激活Akt和ERK等促生存通路发挥神经保护作用，而calpain 2则促进神经退行性变。这种精妙的平衡一旦被打破，便可能引发疾病。在SPG76患者中，CAPN1基因的纯合突变（p.Tyr320Leufs73*）导致calpain 1蛋白完全缺失，但这种缺失如何具体导致神经元功能异常和运动缺陷，其深层机制尚不完全清楚，也缺乏有效的干预策略。为了解决这些问题，本研究团队在《Pharmacological Research》上发表了他们的最新研究成果。
研究人员开展这项研究的主要技术方法包括：利用SPG76患者来源的成纤维细胞进行体外细胞模型研究；通过CRISPR/Cas9技术构建CalpB基因敲除的果蝇（Drosophila melanogaster）模型进行在体功能验证；应用蛋白质印迹（Western Blot）分析关键信号通路蛋白（如Akt、ERK、GSK3β）的磷酸化水平；采用实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）检测未折叠蛋白反应（UPR）相关基因的表达；使用荧光底物法测定calpain酶活性；通过细胞活力检测（如CellTiter-Blue）和 caspase-3/7活性检测评估细胞凋亡；以及利用果蝇负趋地性（negative geotaxis）实验评估运动功能。
3.1. Calpain 1缺失增加SPG76患者来源细胞的自噬体形成并减少促生存通路的激活
研究人员首先在两名携带纯合CAPN1突变（p.Tyr320Leufs73*）的SPG76同胞患者的成纤维细胞中证实，该突变导致calpain 1蛋白完全缺失。与此相反，calpain 2的活性在患者细胞中显著升高。进一步分析发现，calpain 1的缺失导致自噬相关蛋白Atg5的截短形式减少，而Atg12-Atg5复合物、Atg7、Beclin1以及自噬标志物LC3-II和p62的水平升高，表明自噬体的形成增加。通过mRFP-GFP-LC3串联载体实验，他们排除了自噬体-溶酶体融合障碍，支持了自噬流上游环节增强的结论。更重要的是，SPG76细胞中促生存通路Akt和ERK1/2的磷酸化水平降低，导致其下游促凋亡因子GSK3β的抑制性磷酸化（Ser9）减少，同时p38 MAPK的磷酸化水平也下降。在血清饥饿诱导的内质网应激条件下，SPG76细胞表现出更强的未折叠蛋白反应（UPR）激活、更高的细胞凋亡率和死亡率。这些结果表明，calpain 1的缺失破坏了细胞内的稳态，使细胞更容易在应激条件下发生凋亡。
3.2. Calpain 1缺失在ER应激条件下增加SPG76细胞中UPR的激活并诱导凋亡和细胞死亡
为模拟病理条件下的应激状态，研究人员对细胞进行了血清饥饿处理。他们发现，饥饿处理能进一步加剧SPG76细胞中UPR的激活，包括IRE1、XBP1剪接体、GRP94、GRP78、ATF4等基因的表达显著上调，同时促凋亡基因CHOP的表达也升高。延长饥饿时间（9小时和18小时）后，SPG76细胞中活化的caspase 3、7、9水平以及死亡细胞（PI阳性）比例均显著高于对照组细胞。这些数据表明，calpain 1的缺失使细胞对ER应激诱导的凋亡更加敏感。
3.3. Calpain和PTEN抑制剂增加SPG76细胞中的Akt和ERK2通路
基于上述发现，研究团队测试了多种化合物能否挽救SPG76细胞的异常表型。他们选用了calpain抑制剂（ALLN, MDL28170, olesoxime）、PTEN抑制剂（bpv(pic), bpv(HOpic)）、以及GSK3β抑制剂（如tideglusib）等。结果显示，calpain抑制剂MDL28170和olesoxime能有效降低calpain 2的活性，并显著提高Akt和ERK的磷酸化水平，同时增强对GSK3β（Ser9）的抑制。此外，这些化合物（尤其是MDL28170, olesoxime, tideglusib和植物黄酮类化合物naringenin）还能有效降低UPR相关基因和CHOP的表达，减少caspase的活化和细胞死亡，并缓解自噬体的累积。
3.4. Calpain 2抑制和Akt激活挽救SPG76细胞中的凋亡和细胞死亡
进一步的机制验证表明，靶向抑制calpain 2或直接激活Akt通路，是逆转SPG76细胞病理表型的关键。在化合物筛选中，MDL28170、olesoxime、tideglusib和naringenin展现出最佳的挽救效果。
3.5. 果蝇CalpB缺失诱导UPR激活、凋亡和进行性运动缺陷
为了在体验证上述发现，研究团队利用CRISPR/Cas9技术构建了CalpB基因敲除（CalpB -/-）果蝇模型。CalpB被认为是果蝇中CAPN1的直系同源基因。该模型虽然不影响果蝇的羽化率和寿命，但表现出与SPG76患者细胞类似的病理变化：Akt和ERK通路活性降低，UPR被激活，神经元凋亡增加。更重要的是，CalpB -/- 果蝇表现出明显的、随时间加重的运动功能障碍，这是HSP的核心表型。
3.6. MDL28170和olesoxime在CalpB敲除果蝇模型中挽救Akt激活、UPR激活、凋亡和运动缺陷
最后，研究人员在CalpB -/- 果蝇模型上评估了最有潜力的化合物。他们发现，在食物中长期添加MDL28170或olesoxime，能够显著改善果蝇的UPR激活水平，降低caspase活性，并有效挽救其运动缺陷。而tideglusib和naringenin仅在短期治疗中有效，长期效果不佳。
本研究系统地阐明了SPG76-HSP的新机制：calpain 1的缺失打破了与calpain 2的平衡，导致calpain 2活性异常升高，进而抑制了关键的Akt促生存信号通路，并加剧了内质网应激和细胞自噬，最终引发神经元凋亡和运动功能障碍。研究的关键意义在于，不仅利用患者来源细胞和基因工程果蝇模型揭示了疾病机制，还通过药物筛选明确了calpain 2抑制剂（如MDL28170和olesoxime）和GSK3β抑制剂（如tideglusib）等小分子化合物具有显著的治疗潜力，能有效逆转细胞和动物模型中的病理表型。这为开发SPG76乃至其他可能与calpain系统失调相关的神经退行性疾病的靶向治疗策略提供了坚实的理论依据和重要的临床前实验证据。值得注意的是，olesoxime因其良好的安全性已在其他神经疾病的临床试验中进行过测试，这为其用于SPG76的潜在治疗转化增添了希望。未来的研究需要在更高等的哺乳动物模型（如capn1敲除小鼠）中进一步验证这些化合物的疗效和安全性。
