抗人PD-1单克隆抗体在转基因植物中的表达与功能分析

植物生物制药平台通过转基因烟草生产PD-1单抗，验证其纯化与功能，抑制膀胱癌细胞增殖并调控ERK信号通路。

李彩恩|林秀熙|李大元|林正硕|金镇旭|洪顺奥克|李惠俊|高基成|Myung顺哲

韩国首尔中央大学医学院泌尿科

摘要

基于植物的生物制药平台为治疗性抗体的生产提供了一种成本效益高且可扩展的替代方案。在本研究中，我们利用转基因烟草（Nicotiana tabacum）植物表达了pembrolizumab，这是一种针对免疫细胞上的经典PD-1和肿瘤细胞中最近发现的内在PD-1（iPD-1）变体的抗人程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）单克隆抗体（mAb）。这种植物来源的抗PD-1 mAb（mAb^P PD-1）通过SDS-PAGE和免疫印迹技术成功纯化并得到了验证。使用ELISA和免疫组化进行的功能分析表明，mAb^P PD-1对重组人PD-1具有很强的结合亲和力，并能有效检测人扁桃体组织中的PD-1表达。重要的是，细胞实验表明，mAb^P PD-1能够有效结合表达iPD-1的膀胱尿路上皮癌细胞系，从而显著抑制细胞增殖。Western blot分析显示，mAb^P PD-1在不改变总ERK水平的情况下显著抑制了细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化，表明其直接调节与肿瘤细胞增殖相关的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。这些发现表明，转基因烟草植物是一种成本效益高且可扩展的平台，可用于生产具有强大免疫调节和抗增殖特性的功能性抗PD-1抗体。同时靶向免疫细胞PD-1和肿瘤细胞iPD-1，进一步凸显了植物来源抗体在癌症免疫治疗中的治疗潜力。

引言

免疫检查点在维持免疫系统平衡和防止过度免疫激活方面起着关键作用。在正常生理条件下，CTLA-4、PD-L1和PD-1等检查点蛋白通过平衡促炎和抗炎信号来调节免疫细胞功能（Cai等人，2021年；Pardoll，2012年）。免疫检查点抑制剂（ICIs）通过阻断这些通路，增强了免疫系统识别和消除癌细胞的能力，从而彻底改变了癌症治疗（Robert，2020年）。与传统治疗方法不同，ICIs能够刺激机体自身的免疫反应，提供了一种有针对性和持久的治疗策略（Cai等人，2021年）。

过去十年中，针对CTLA-4和PD-L1的单克隆抗体（mAbs）已经显示出临床疗效；然而，针对PD-1的抗体尤其强大。PD-1也称为CD279，由PDCD1基因编码，它不仅表达在T淋巴细胞上，还以内在变体形式存在于肿瘤细胞中（iPD-1），在恶性肿瘤进展中起着关键作用（Chen等人，2023年）。尽管iPD-1具有重要的生物学意义，但迄今为止受到的关注相对较少。阐明其功能对于理解肿瘤发展至关重要，并突显了它在免疫肿瘤学中的独特性和临床相关性。

pembrolizumab（Keytruda®）是一种高度选择性的IgG4-kappa人源化mAb，用于治疗转移性膀胱尿路上皮癌——既可以单独使用，也可以与enfortumab vedotin联合使用——以及对卡介苗（BCG）治疗无反应的高风险非肌层浸润性膀胱癌（Darvin等人，2018年；Apolo等人，2025年）。对于不适合或不愿意接受根治性膀胱切除术的患者，pembrolizumab单药治疗耐受性良好，并显示出有希望的抗肿瘤活性，为这一难以治疗的群体提供了一种有效的非手术治疗选择（Balar等人，2021年）。

目前，pembrolizumab是在哺乳动物表达系统中生产的，主要是使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，但这存在生产成本高、生物安全风险以及处理复杂等问题（Stark等人，2023年）。相比之下，基于植物的表达系统具有明显优势，如成本效益高的生物质生产、降低动物病原体污染的风险以及更好的可扩展性（Jin等人，2025年）。重要的是，稳定的转基因植物可以通过种子实现长期储存，并为治疗性抗体的大规模、低成本生产提供了一个可行的平台（Chen等人，2013年；Peyret和Lomonossoff，2013年）。这种被称为“植物分子农业”的方法已成为生产安全且价格合理的重组生物制品（包括治疗性抗体）的有希望的替代方案（Shanmugaraj等人，2020年）。

在本研究中，我们建立了表达pembrolizumab（抗PD-1抗体）的转基因烟草植物，并证实植物来源的抗PD-1 mAb（mAb^P PD-1）与其哺乳动物来源的抗PD-1抗体（mAb^M PD-1，即Pembrolizumab）具有相当的结合亲和力。本研究直接比较了植物来源和哺乳动物来源的抗体，同时强调了同时靶向免疫细胞PD-1和肿瘤细胞iPD-1的生物学意义。此外，我们的结果通过抑制肿瘤细胞增殖和调节细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路（膀胱癌进展的关键介质）展示了其功能相关性。总体而言，这些结果表明转基因烟草植物是一种稳定且可扩展的平台，可用于生产具有强大免疫调节和抗增殖特性的重组抗PD-1抗体，凸显了它们在癌症免疫治疗和生物制药制造中的潜力。

部分内容片段

基于植物的表达载体的构建

用于编码针对人PD-1的单克隆抗体pembrolizumab的重链（HC）和轻链（LC）的基因序列来自DrugBank数据库（DrugBank ID：DB09037）。每个序列都经过密码子优化，以适应在N. tabacum中的表达。为了促进内质网（ER）定位，在HC的C末端融合了一个KDEL ER保留基序。优化后的HC和LC片段被合成并插入到二元载体pBINPLUS中（van Engelen等人，

产生重组mAb PD-1的稳定植物系的开发

通过Agrobacterium介导的基因转移方法生成了转基因N. tabacum植物（图1A，B）。通过PCR和免疫印迹技术评估了转基因的整合以及mAb PD-1 HC和LC的表达情况。随机选择了8个转基因系进行PCR分析，确认了构建体的成功整合（图1C，左）。免疫印迹进一步证实了这些系中目标蛋白的存在（图1C，右）。这些结果共同证明了

讨论

PD-1主要表达在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上（Boussiotis，2016年）。然而，新的证据表明，iPD-1在癌症进展中起着与适应性免疫功能无关的、依赖于具体情境的作用。值得注意的是，iPD-1已被证明可以抑制非小细胞肺癌和结肠癌的肿瘤发生，而在黑色素瘤、肝细胞癌、胰腺导管腺癌等其他恶性肿瘤中则促进癌症进展

伦理批准声明

所有实验程序均获得了中央大学医学院机构审查委员会的批准（批准编号：2090-006-434）。

患者同意声明

不适用

允许复制其他来源的材料

不适用

临床试验注册

不适用

资助

本工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）的支持，资金来自韩国政府的资助：科学信息通信技术部（MSIT）的NRF-2020R1A2C201065215项目和教育部的基础科学研究计划下的RS-2025-25432041项目。

CRediT作者贡献声明

李大元：方法学研究。林秀熙：写作——审稿与编辑、可视化、验证、方法学研究、数据管理。Myung顺哲：写作——审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金筹集、概念构思。李彩恩：写作——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、软件应用、方法学研究、数据管理、概念构思。洪顺奥克：验证、方法学研究。金镇旭：验证。高基成：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。