摘要
鸟巢真菌（Nidula candida）在太平洋精神公园地区约18年树龄的雪松围栏上大量生长，产生富含担孢子的、蛋状的包被（peridioles）。研究通过几何采样设计收集了37个包被（peridia），旨在重建种群的初始繁殖模式。研究利用从每个包被的一个完整包被（peridiole）培养的双核菌丝体（dikaryotic mycelium）以及从8个包被的担孢子（basidiospores）获得的105个单核体（monokaryons），通过菌丝体对峙和单核体杂交测试了菌丝体兼容性（mycelial compatibility）和性兼容性（sexual compatibility）。结果表明，从完整包被长出的双核菌丝体可分为6个菌丝体兼容性组（mycelial compatibility groups），每个围栏段有1-2个组。最大的兼容性组覆盖了超过6米的围栏，产生了114个包被和约42亿个孢子。一个兼容性组出现在相距约40米的两个围栏点，表明存在无性传播。从同一包被的担孢子分离的单核体杂交产生的双核体在86%的组合中表现出菌丝体不亲和性，因此从完整包被长出的兼容双核菌丝体很可能代表亲本菌丝体的克隆，而非来自担孢子的重组减数分裂菌丝。
引言
在自然环境中研究蘑菇形成真菌的个体大小和种群历史具有挑战性，因为菌丝体的范围难以追踪。与大多数蘑菇形成真菌不同，覆盖在太平洋精神公园雪松围栏上的白类白蛋巢菌易于采样分析菌丝体个体性。其杯状包被（peridia）持有包被（peridioles），这是一种独特的传播机制——溅杯（splash cup），雨滴落入包被时可将包被溅出数米远。丰富的鸟巢真菌包被全年存在于太平洋精神公园，围栏提供了一个采样框架，可以测量线性距离并可视化菌丝体的可能范围。
为了识别N. candida个体，研究利用了非自我识别机制，通过观察来自收集包被的培养物如何相互作用来调节菌丝体之间的融合。担子菌至少有两种非自我识别机制，分别在不同的生命阶段起作用。在严格异宗配合（heterothallic）真菌中，体细胞（FIG. 2B）和性（FIG. 2F）兼容系统具有相反的效果：体细胞兼容只允许遗传相同的菌丝体融合，而性兼容只允许遗传不同的菌丝体融合。通过体细胞和性兼容分组，子实体的空间分布可以指示菌丝体个体在其基质中的大小，并为了解其繁殖输出和繁殖机制提供见解。
材料与方法
采样策略
在太平洋精神区域公园（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）选择了四个在2023年秋季有大量N. candida包被的围栏地点进行采样。三个地点来自Sasamat小径，位于同一连续围栏上，但分别间隔约40米（地点1至地点2）和190米（地点2至地点3）。第四个地点位于Council小径，距Sasamat地点约1.7公里。每个地点有3-7.5米人口密集的围栏，包被之间的间隙不超过2米。2024年2月，收集了37个包被并风干。
标本鉴定
N. candida的鉴定基于与原始描述的比较以及纽约州博物馆提供的正模标本照片。与Peck描述共有的特征包括直径0.9-1.3毫米的包被，以及“透镜状、棕色、带有众多发散和交叉的黑线”。然而，Nidula属的物种名称应用多年来不一致，名称N. candida和N. niveotomentosa常被应用于我们地区的同一物种。
从完整包被分离双核培养物及菌丝体兼容性测试
从每个包被的一个包被分离双核培养物，目的是将收集物分配到菌丝体兼容性组。每个包被表面用70%乙醇消毒10秒，风干，切成两半，放在麦芽提取物琼脂上。双核菌丝在室温培养2-3天后出现。菌丝体兼容性通过将两个双核菌丝体的3毫米直径琼脂块在麦芽提取物琼脂上配对约1厘米来评估。配对菌丝体在相互作用点产生隆起菌丝线的被指定为不兼容，没有产生的被指定为兼容。
单核培养物分离及性兼容性测试
为了测试性兼容性，从单个担孢子分离单倍体单核培养物。从代表每个兼容性组的一个包被中选择包被。具体选择了来自以下包被的包被：第1组，包被2；第2组，包被5和12；第4组，包被24；和第6组，包被43。由于担孢子萌发不良，未包括兼容性组3和5。
菌丝体范围和围栏种群繁殖输出的估计
每个兼容性组占据的围栏长度基于采样包被之间的距离估算。兼容性组之间的边界假定为相邻不兼容包被之间的中点，不连续的兼容段相加得到总长度估计。
包被和担孢子计数估计
根据围栏收集的22个成熟包被估计每个包被的担孢子数量。从每个包被取一个大包被放入1.5微升微量离心管中，加入400微升水和100微升1% Liquinox洗涤剂，帮助将孢子与皮层菌丝分离，用研杵研磨直至仅可见小块。涡旋试管，用血球计数器对0.1微升孢子数计数五次取平均值。
亲缘双核体间的兼容性
源材料包括来自五个代表不同菌丝体兼容性组的包被的萌发包被和萌发担孢子的双核体。通过单核体杂交产生全同胞相关双核体和代表其他六种亲缘关系的双核体。
结果
围栏上个体分布，从完整包被培养物的菌丝体兼容性推断
菌丝体兼容性测试从37个完整包被长出的双核菌丝中识别出六个独特的兼容性组。兼容性在围栏地点内占主导（154次对峙中的122次，79%）。三个地点各由两个兼容性组占据，一个围栏地点由一个组占据。相比之下，不同围栏地点分离株之间的18次对峙中有17次不兼容（94%）。只有一个组在多个围栏地点被识别；第2组的代表出现在Sasamat地点1和2，相距约40米。
来自担孢子的性兼容性和交配型分布
各菌丝体兼容性组代表之间的性兼容性测试表明，每个组具有独特的交配型等位基因组合，总共15种不同的交配单倍型，表明独立的性起源。来自包被5和12的双核培养物，虽然来自不同的围栏段，但代表相同的菌丝体兼容性组（第2组），从其包被选出的单核培养物共享所有四个交配型等位基因。
孢子和包被计数结果
每个包被含有估计150,000–520,000个孢子，平均330,000 ± 23,455 (n=23)。每个包被含有45–217个包被，平均110 ± 52 (n=17)。因此，一个包被可能产生670万至1.1亿个孢子，平均约3700万个孢子。将这些估计应用于围栏收集物，一个负责146个包被的大型个体可能产生高达170亿个孢子，包装在31,682个包被中。最小兼容性组（仅由两个包被代表）将产生至少1300万个孢子。
完整包被培养物中菌丝的起源
来自不同包被和不同包被培养的双核体具有规则锁状联合，经常显示菌丝体兼容性。兼容性的优势提出了双核菌丝可能起源于包被内体细胞菌丝的克隆，而非来自配对、萌发的担孢子的可能性。
实验室合成的亲缘双核体间的菌丝体不亲和性
已知亲缘程度实验室合成双核体之间的对峙证实，遗传相同的个体显示菌丝体兼容性，但减数分裂后代配对最常见的结果是菌丝体不亲和性。来自同一包被不同完整包被（而非分离担孢子）的双核体之间的7次配对均产生菌丝体兼容性。然而，将同胞组成双核体（来自分离担孢子）与完整包被双核体配对，即使担孢子和完整包被来自同一包被，10次配对中有6次（60%）不兼容。亲缘密切的同胞组成双核体配对在50次测试中有43次（86%）产生不兼容性。
讨论
围栏种群菌丝体范围和繁殖输出的估计
基于兼容性组的空间分布，单个N. candida个体可沿围栏栏杆检测到长达6米——相对于其繁殖体大小而言面积很大，但与其他几种木材腐烂担子菌的菌丝体范围相当。在N. candida中，每个320-679厘米围栏段仅由一或两个个体占据。假设太平洋精神公园围栏上的N. candida菌丝体必须比其围栏基质年轻，它们不到18年。因此，在Sasamat围栏上产生相距640厘米包被的单个径向扩展菌丝体的最小生长速率约为18厘米/年。
对繁殖策略和围栏种群起源的见解
菌丝体不亲和性和多样的交配特异性指向不同围栏段菌丝体的有性、异交起源
来自不同围栏包被的双核菌丝体配对时产生不兼容性。一个例外，来自相同兼容性组（第2组）的菌丝体来自围栏段Sasamat 1和Sasamat 2。这些兼容菌丝体共享相同的交配型等位基因，可能代表一个克隆。四个围栏样本中交配型的多样性，一个位点有6个等位基因，另一个有9个，与多次定殖事件一致，由异交和分散的、遗传可变的担孢子引发。
从完整包被长出的双核菌丝体更好地解释为亲本菌丝体的克隆，而非担孢子萌发的产物
这是基于意外发现，收集间隔达6米的包被菌丝体显示菌丝体兼容性。来自同一包被不同包被的双核菌丝体总是显示菌丝体兼容性，沿围栏段不同包被的双核菌丝体通常也显示菌丝体兼容性。相比之下，来自同一包被同胞担孢子实验室产生双核体的菌丝体几乎总是不兼容（50次配对中的43次，86%）。
分散包被的克隆生长可能使菌丝体个体沿围栏栏杆“跳跃”
菌丝体生长必须是解释沿围栏段延伸的单个菌丝体个体的部分原因。然而，如果包被在自然界中像实验室中一样萌发产生遗传相同的菌丝体，它们可能加速沿围栏栏杆的定殖。溅杯实验证明，Nidula包被可通过从3米高处落下的水滴从其包被溅出最大41-50厘米。跳跃的包被可能导致多个接种点，并可解释，例如，第2组菌丝体出现在两个看似不连续的Sasamat小径围栏段。更显著的是，跳跃的包被可解释如何相同的多位点微卫星基因型由收集相隔380米的Cyathus stercoreus包被共享。
Nidula candida，进一步研究担子菌门体细胞不亲和性遗传学的有前景物种
尽管担子菌性兼容系统相对较好表征，体细胞不亲和性的遗传基础仍然知之甚少。Nidula candida提供比较密切相关的兼容和不兼容基因组的机会，可加速在分子水平发现控制不亲和性的候选基因。Nidula candida显示一致、快速和宏观可见的不亲和反应。大多数包被的担孢子容易萌发成单核体，亲本基因型的双核菌丝在3天内从完整包被长出，促进基于培养的分析。
结论
结合我们的菌丝体兼容性和N. candida交配型的空间显性研究，指出围栏段最初由来自担孢子的异交繁殖体定殖，随后沿围栏段体细胞生长或克隆扩张。单个菌丝体每年产生大量担孢子，有助于新的、有性衍生个体的概率。单个菌丝体产生大量包被，从亲本包被溅出。包被可能破裂释放担孢子导致异交菌丝体的新建立，但我们证明包被也能够克隆生长，分散的包被可能有助于沿四个围栏段每个占主导的遗传个体的扩展。
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