作者：Rachel Smith、Colin Guy、Rosie Upton、Sam Clawson、Henry Fisher、Mohammad Adam Nasar、David Firth、Allan Watkinson
公司：Labcorp Harrogate，地址：Otley Road, Harrogate, HG3 1PY, 英国
摘要
我们开发了一种简化后的单克隆抗体（mAb）早期配方开发工作流程，旨在提高效率、降低成本并缩短时间线，同时不牺牲产品质量和患者安全。该流程结合了液相色谱-质谱多属性分析（LC-MS MAM）和表面等离子体共振（SPR）技术来检测配体结合。通过这两种方法，可以全面了解mAb的关键质量属性（CQAs），并建立结构与功能之间的关联。由于LC-MS MAM无法涵盖所有降解方面的信息，因此还评估了用于分析高分子量物质（HMWM）、构象稳定性和胶体稳定性的高通量方法。工作流程包括初步的强制降解研究，以验证稳定性指标并识别潜在的降解途径；其次根据构象稳定性和胶体稳定性确定最佳pH值；最后通过实验设计（DoE）评估稳定剂的效果。我们使用pembrolizumab验证了这一流程。在初步的强制降解研究中，LC-MS MAM和PD-1配体结合分析确定了主要的关键质量属性。研究发现，位于CDR3区域的Met105氧化是主要的问题。实验设计表明，25 mM的甲硫氨酸可以抑制Met105氧化并稳定PD-1结合。通过这种简化流程，在pH 5.5条件下，使用20 mM组氨酸、25 mM甲硫氨酸、0.02% PS80和300 mM蔗糖作为稳定剂，成功提高了蛋白质的稳定性。该流程有望减少早期开发所需的昂贵材料，降低成本并缩短时间线。
引言
生物制药行业一直在寻求简化流程以提高效率、降低成本和缩短时间线，同时不牺牲生物制剂的质量和患者安全。这对于处于早期开发阶段、资源有限的小型和中型生物技术公司尤为重要，他们希望将产品推向临床。为了简化单克隆抗体（mAb）的配方开发并减少资源消耗，我们采用了一种结合液相色谱-质谱多属性分析（LC-MS MAM）和表面等离子体共振（SPR）的新方法。这种方法的优势在于可以快速关联mAb的关键质量属性（CQAs）与配体结合情况，从而识别并解决影响效力的问题。
LC-MS MAM是一种质谱技术，自2015年引入以来在生物制药行业中得到广泛应用。[1]该技术的优势在于能够同时监测多个属性（通常在肽水平），包括一级序列，并识别和相对定量翻译后修饰（PTMs），从而在单次检测中全面评估mAb。[2],[3],[4] MAM实验生成的数据还可以用于检测样品中出现但参考材料中没有的新或修饰物种。LC-MS MAM的关键在于其出色的检测限，能够检测到低丰度的物种，如杂质或微量存在的变异体。
MAM是在成熟的LC-MS肽图谱技术基础上发展起来的，利用特定的蛋白质切割产物（通常是酶促切割）生成肽，然后通过LC分离并通过质谱仪鉴定。MS/MS分析（在本研究中为MSE 分析）可以确定肽的氨基酸序列，而不仅仅是整体质量，从而实现特定位点的PTMs鉴定。虽然传统的肽图谱方法需要对蛋白质进行全面表征（可能需要大量时间处理数据），但MAM则针对特定的蛋白质修饰位点。在MAM实验的“发现阶段”，通过参考材料和其他样品（例如强制降解样品）的LC-MS肽图谱分析来确定PTMs和感兴趣的位点（尤其是CQAs）。降解样品也可以纳入分析，因为它们会产生更高水平的翻译后修饰肽，这些样品的表征有助于生成可靠的MS/MS数据。肽鉴定结果会被保存到肽库中，用于跨多个样品和分析一致地监测选定的PTMs。LC-MS MAM与肽图谱的区别在于数据处理方式，如果需要监测更多属性或对样品进行全面表征（例如强制降解样品），则可以在后续处理MAM实验获得的数据集。
尽管LC-MS MAM在全面表征mAb一级结构方面非常有效，但某些降解事件可能不会影响mAb与其配体的结合能力。为了解决这个问题，工作流程将LC-MS MAM与SPR配体结合技术结合起来，以提供结构与功能的数据。
SPR能够实时检测mAb与配体的相互作用，无需标记，通过测量传感器芯片表面的质量变化来实现。[5]利用SPR可以确定结合常数并监测结合和解离速率的变化。因此，SPR广泛用于抗体-配体结合动力学的分析，可视为一种体外效力检测方法。该技术的灵敏度和重复性使得在稳定性和强制降解研究中能够检测和表征结合亲和力的变化。
LC-MS MAM与SPR配体结合技术的结合使用，可以将降解事件与mAb结合情况相关联。这种理解有助于直接识别关键质量属性（CQAs），进而指导配方设计，确定需要评估的稳定剂。SPR配体结合还可以作为更高阶结构的指标，因为二级和三级结构的扰动可能会影响效力。[6]
LC-MS MAM产生的综合数据集表明，该技术可以替代mAb开发中常用的某些传统LC和电泳方法。因此，它可以简化配方开发流程，减少优化mAb配方所需的分析方法数量，从而缩短时间线、降低材料需求和成本。此外，简化流程还能减少样品用量，这在早期开发阶段尤为重要，因为材料通常非常有限。因此，我们希望全面评估LC-MS MAM技术在mAb配方开发中的应用。总体目标是开发一个以MAM为核心的工作流程，同时包含有限的额外蛋白质分析技术，但仍能全面了解mAb的降解途径和稳定剂的效果。
由于LC-MS MAM能够识别和量化即使是微量的PTMs，因此有必要将观察到的PTMs与其生物学功能联系起来。mAb的蛋白质链可能会发生多种化学修饰，其中一些可能对mAb的功能影响很小或没有影响。
虽然配方开发流程主要基于LC-MS MAM和SPR配体结合，但该简化分析流程还包含了传统的分析方法，以了解胶体/构象稳定性、寡聚化和聚集现象。
工作流程的初始步骤是进行强制降解研究，采用热处理、氧化处理和光照处理，以确认LC-MS MAM是有效的稳定性指标方法，并能检测到多种PTMs，即使是在低水平下的PTMs。同时，由于pH值可能是mAb配方设计中最重要的因素，我们还进行了pH值筛选，以确定最佳的pH条件。这些初步工作以及先前的知识为后续的实验测试奠定了基础。为了进一步简化流程，我们遵循ICH Q8（R2）[7]和质量源于设计（QbD）的要求，采用了实验设计（DoE）统计方法来评估稳定剂的效果。DoE能够在最少的样品数量下提供最多的数据，从而减轻分析负担。
在本研究中，我们选择了pembrolizumab作为模型mAb。pembrolizumab是一种针对程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的人源化mAb。[8]其结构为IgG4/kappa亚型，Fc区域具有S229P突变，可防止IgG4 Fab臂的交换。该mAb作为突破性的免疫疗法，单独使用或与其他肿瘤疗法联合使用，对多种癌症的治疗具有重要意义。[9],[10]它通过抑制PD-1与PD-L1或PD-L2的结合来阻断免疫耐受性，从而抑制抗肿瘤T细胞的抑制作用。选择pembrolizumab的另一个原因是它属于IgG4亚型，因此结构稳定性低于IgG1和IgG2亚型。[11],[12]因此，预计pembrolizumab会比相应的IgG1 mAb经历更多的应力相关降解事件，适合用于测试我们的配方开发流程。
化学与材料
pembrolizumab（Keytruda®，Merck & Co., Inc.，美国新泽西州Rahway，批号7SNL81703、R004813、8302611A01和S029483）由制药供应商提供。除7SNL81703外，所有批号均以25 mg/mL的浓度提供溶液形式。7SNL81703批号为冻干粉，需按照制造商说明用无菌水复溶，配制成25 mg/mL的溶液。所有批号的配方相同。
结果与讨论
任何治疗性mAb工艺开发的关键部分是配方开发，其目的是优化缓冲剂和稳定剂，以最小化降解，确保适当的保质期、产品效力和患者安全。在mAb配方开发中，有多种方法可供选择，其中传统方法使用多种分析技术，包括液相色谱和电泳方法。
总结
总之，在生物制药开发中，人们不断努力开发更高效的流程，以降低成本和缩短时间线，同时不牺牲生物制剂的质量和患者安全。LC-MS MAM的应用提供了一种单一分析方法，可以全面了解mAb的化学降解途径以及稳定剂的影响。
作者贡献
本手稿由A.W.、R.S.和C.G.撰写和审阅。研究的概念构思由A.W.和D.F.完成。实验设置、数据分析和处理由R.S.、H.F.、C.G.、A.N.、R.U.和S.C.负责。所有作者均同意最终版本的手稿。
数据声明
虽然科学数据属于Labcorp所有，用于评估简化后的配方开发流程，但可根据需求提供数据副本。
作者贡献声明
Colin Guy： 撰写、审阅与编辑、方法学设计、实验设计、数据分析。
Rosie Upton： 方法学设计、数据分析。
Sam Clawson： 方法学设计、数据分析。
Allan Watkinson： 撰写、审阅与编辑、初稿撰写、项目监督、数据分析、概念构思。
Rachel Smith： 撰写、审阅与编辑、项目监督、方法学设计、实验设计、数据分析。
Mohammad Adam Nasar： 方法学设计、数据分析。
Henry Fisher：
利益冲突声明
本工作完全由Labcorp资助。所有作者在研究期间均为Labcorp的员工。
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