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乳腺癌新辅助化疗（NACT）中，传统药物递送系统因释放缓慢和靶向性不足影响疗效。本研究通过共聚N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、N-异丙基丙烯甲酰胺（NIPMAM）和甲基丙烯酸（MAA），制备出pH和热双响应微凝胶。在模拟肿瘤微环境（pH5.0, 42°C）下，微凝胶4小时内实现58.99%的阿霉素（DOX）突释，显著高于生理条件（21.00%）。体外实验显示，DOX负载微凝胶对MCF-7乳腺癌细胞存活率降至39.36%（4.0 µg/mL），同时有效降低高浓度DOX对正常细胞的毒性。该系统通过双响应机制实现肿瘤特异性高效释放，为提高NACT病理完全缓解率（pCR）和降低全身毒性提供新策略。
张子墨|吴耶阳|邢明宇|张明双|萨伊玛·萨达夫|王雅
中国珠海市，广东省级/珠海市IRADS重点实验室，北京师范大学-香港浸会大学生命科学系，邮编519087
摘要
局部新辅助化疗（NACT）是一种广泛用于乳腺癌治疗的策略，旨在手术前缩小肿瘤体积并提高病理完全缓解（pCR）的比率，这是长期良好预后的关键指标。然而，NACT的治疗效果常常受到传统药物输送系统的限制，这些系统由于药物释放缓慢且不具特异性，无法在关键的早期治疗窗口内达到足够的药物浓度。为了解决这一问题，我们通过N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、N-异丙基甲基丙烯酰胺（NIPMAM）和甲基丙烯酸（MAA）的共聚反应制备了一种可注射的、对pH值和温度双重敏感的微凝胶。这些微凝胶专门设计用于响应乳腺肿瘤微环境（TME）的酸性和高温条件，从而实现封装药物多柔比星（DOX）的肿瘤特异性爆发性释放。在模拟的TME条件下（pH 5.0，42°C），微凝胶在4小时内实现了58.99%的DOX爆发性释放，而在生理条件下（pH 7.4，37°C）仅释放了21.00%。体外研究进一步表明，在4.0 µg/mL的DOX等效浓度下，载有DOX的微凝胶在48小时后可将MCF-7乳腺癌细胞的存活率降低至39.36%。此外，这些微凝胶还能有效减轻高浓度DOX对正常细胞的细胞毒性，保持更高的细胞存活率。这些发现凸显了这种双重敏感微凝胶系统作为局部NACT创新平台的潜力，能够提高治疗效果、改善pCR比率并降低全身毒性。
引言
乳腺癌是全球诊断出的最常见的癌症，2022年新增病例230万例，死亡人数约67万例，是女性癌症相关死亡的主要原因[1]。其高发病率和死亡率强调了有效治疗的迫切需求。几十年来，化疗一直是乳腺癌治疗的基石，适用于疾病的各个阶段，包括新辅助（术前）、辅助（术后）和转移性治疗[2]。其中，新辅助化疗（NACT）通过术前缩小肿瘤体积，提供了增加保乳手术机会的机会，并能预先激活全身抗肿瘤免疫反应，从而降低术后复发和转移的风险[3][4][5]。这种治疗的效果至关重要，因为实现病理完全缓解（pCR），即切除组织中无残留侵袭性癌症，是长期良好预后的强大预测指标[6][7]。然而，化疗的机制存在显著挑战：虽然它能够靶向并杀死所有快速分裂的细胞，但无法区分癌细胞和健康增殖细胞。这种缺乏特异性常常导致骨髓、毛囊和消化道黏膜等副作用[8]。此外，仅仅增加传统化疗的剂量并不能提高pCR率和整体疗效，需要与靶向疗法结合使用[9][10]。
局部治疗对于乳腺癌的治疗具有很大前景，因为它能够精确地定位病变部位，有效降低复发风险并提高患者的生活质量[11][12][13]。此外，这种系统可以利用肿瘤微环境（TME）的独特生物学特性，确保化疗药物的高效和部位特异性释放，最大化其治疗效果。乳腺癌TME的两个关键生理特征常被用作药物输送系统的内源性刺激因素：细胞外酸中毒和局部高温[14]。癌细胞的有氧糖酵解代谢模式（即Warburg效应）加上肿瘤灌注不足，导致酸性代谢产物的积累。值得注意的是，Feng等人的最新研究[15]发现，乳腺癌细胞表现出严重的细胞外酸性区域，局部细胞外pH值可降至5.3以下，这是由于质子和乳酸的定向共排出。同时，有氧糖酵解产生的大量热量以及癌细胞中血液灌注的改变导致肿瘤区域的温度显著高于周围正常组织，形成局部高温[16]。根据Lozano和Hayes提出的热力学模型[17]，乳腺癌组织内的最高温度范围在42.2°C至50.8°C之间。
乳腺癌的局部化疗通常使用微创药物输送系统形成局部药物库以实现持续释放，这种方法在预防术后肿瘤复发方面显示出巨大价值[18][19][20]。然而，NACT需要快速显著地减少肿瘤体积以提高pCR的概率。根据Hylton等人的模型[21]（AUC = 0.70，95% CI，0.61–0.79），早期治疗（第一个化疗周期后）肿瘤体积的减少程度与实现pCR的可能性呈显著正相关。因此，许多现有局部疗法的缓慢药物释放动力学可能成为限制因素，因为这可能阻止局部药物浓度在早期治疗窗口内达到治疗阈值[22]。
为了更好地满足NACT对快速疗效的需求，必须开发一种能够在TME内实现快速可控药物释放的输送系统。微凝胶非常适合这一目的，因为它们的微米级尺寸和大比表面积能够更快地响应TME刺激，从而实现药物的爆发性释放[23]。例如，Zeng等人开发了一种使用丝素纤维蛋白和壳聚糖通过转谷氨酰胺交联的混合微凝胶，用于益生菌的口服输送。当暴露于含有中性pH值胰蛋白酶的模拟肠液中时，微凝胶表现出靶向的爆发性释放特性，在30分钟内实现了超过90%的益生菌释放[24]。基于聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）的微凝胶也因其对生理温度的强烈温度响应而被广泛研究用于局部治疗。通过与含有酸性基团的功能单体的共聚，可以进一步增加对TME的敏感性[25][26][27]。例如，通过半批量工艺合成的微胶囊在pH 5.0和3% H₂O₂条件下，8小时内释放了约65%的DOX，显示出pH值和氧化引发的爆发性释放[28]。然而，这些爆发性释放微凝胶在NACT中的应用仍相对较少探索。
本项目旨在开发一种具有pH值和温度双重敏感性的新型可注射微凝胶，用于乳腺癌的局部NACT（图1）。该微凝胶通过使用N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、N-异丙基甲基丙烯酰胺（NIPMAM）和甲基丙烯酸（MAA）作为单体，通过沉淀聚合法制备。微凝胶的温度响应性通过NIPAM和NIPMAM的共聚精确调节。虽然单独的p(NIPAM)的体积相变温度（VPTT）为32°C[29,30]，对于体内应用来说太低，而p(NIPMAM)的VPTT为44°C[31]，又太高。因此，它们的共聚预计能够实现略高于正常生理温度（37°C）的最佳VPTT，使其对肿瘤的局部高温具有响应性。同时，为了专门利用乳腺癌的酸性TME，引入了pH敏感单体MAA（pKa≈4.6），从而实现pH依赖性的温度控制。在生理pH值下，去质子化的MAA基团（-COO⁻）产生静电排斥，使VPTT显著升高，确保稳定性并防止药物过早释放。当到达酸性TME时，这些基团被质子化（-COOH），减少静电排斥并降低VPTT，使其与肿瘤的局部高温相匹配，实现药物释放[32]。这种对pH值和温度的协同响应性使微凝胶能够在肿瘤部位特异性释放封装药物，提高治疗精度和疗效。对于新辅助化疗而言，快速显著的肿瘤缩小至关重要，这种靶向和可控的释放机制可以有效提高局部药物浓度，从而增加实现病理完全缓解（pCR）的可能性，同时降低全身毒性。
材料
N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM，99.65%）购自浩鸿生物科技有限公司。N-异丙基甲基丙烯酰胺（NIPMAM，97%）、甲基丙烯酸（MAA）、N,N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA，99%）和过硫酸铵（APS，98%）购自Aladdin（上海，中国）。多柔比星（DOX，99.5%）购自巴斯夫生物科技有限公司（合肥，中国）。磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）购自Biosharp（北京，中国）。醋酸钠缓冲液（pH 5.0）
p(NIPAM-共-NIPMAM-共-MAA)微凝胶的特性
通过沉淀聚合法将三种单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、N-异丙基甲基丙烯酰胺（NIPMAM）和甲基丙烯酸（MAA）共聚，制备了p(NIPAM-共-NIPMAM-共-MAA)微凝胶。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认了微凝胶的成功合成。如图2A所示，微凝胶显示了所有三种单体单元的特征吸收带。
结论
制备了一种对pH值和温度双重敏感的可注射微凝胶，以实现乳腺癌局部新辅助化疗（NACT）中多柔比星（DOX）的快速、肿瘤特异性爆发性释放。该微凝胶通过N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、N-异丙基甲基丙烯酰胺（NIPMAM）和甲基丙烯酸（MAA）的沉淀聚合法合成。其双重敏感性通过pH依赖性的体积相变温度（VPTT）得到验证，该温度从44.60°C变化
资助
本工作得到了国家自然科学基金（52303176）、广东省高等教育提升计划（2021-2025年）“冲刺一流，补齐短板，强化特色”（UICR0400018-23）以及北京师范大学研究资助（UICR04202403-21、UICR0300027）的支持。
CRediT作者贡献声明
张子墨：撰写 – 原稿、方法学、研究、数据分析、数据管理。
吴耶阳：方法学、数据分析。
邢明宇：数据管理。
张明双：方法学。
萨伊玛·萨达夫：撰写 – 审稿与编辑。
王雅：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、数据分析、概念构思。
