临床微生物实验室中两种MALDI-TOF MS系统的鉴定准确性及工作流程效率比较

本研究对VITEK MS PRIME（VMP）和MALDI Biotyper Sirius（BS）两款基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）系统进行了全面评估，涵盖927株临床分离株（含219种物种）的鉴定准确性、短时培养血培养病原体快速鉴定能力以及工作流程效率。结果显示两系统在属、种水平一致性高（分别为99.4%和97.5%），但VMP在短时培养鉴定率（99.2% vs 88.2%）和自动化流程中体现更优的操作效率，为临床实验室优化病原体鉴定流程提供了实证依据。

ABSTRACT

本研究旨在常规实验室环境下比较VITEK MS PRIME（VMP）与MALDI Biotyper Sirius（BS）系统的鉴定准确性及工作流程。共分析927株分离株，涵盖219个不同物种。此外，对119份阳性血培养物在转种培养4–6小时（使用或不使用甲酸处理）及18–24小时后的鉴定结果进行对比。基于模拟单名技术人员日常工作量（16张靶板，每板16个样本，共256个分离株）的工作流程，测量手动操作时间（HOT）和结果出具时间（TTR）。在927株测试菌株中，两系统均展示高鉴定率（BS为91.1%，VMP为95.5%）。重新测试后，两MALDI-TOF仪器在属和种水平的一致性分别为99.4%和97.5%。在短时培养中，未使用甲酸时VMP鉴定出118株（99.2%），使用甲酸时鉴定出113株（95.0%）；BS则分别为105株（88.2%）和110株（92.4%）。工作流程分析显示，VMP的HOT为106分钟，TTR为191分钟，成功鉴定252株（98%）；而BS的HOT与TTR均为155分钟，成功鉴定211株（82%）。两种MALDI-TOF系统在广泛物种鉴定中表现出极好的一致性，可根据实验室具体设置选择适合系统以支持高效、流线型的工作流程。

INTRODUCTION

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）能够基于微生物的蛋白质谱对培养物中的细菌和真菌进行鉴定。该技术已在很大程度上取代传统生化方法，成为细菌和酵母分离株鉴定的金标准。MALDI-TOF MS是一种快速、经济的方法，能够准确鉴定多种临床相关微生物。快速可靠的病原体鉴定有助于靶向治疗并节省医疗系统成本。在临床实验室中，MALDI-TOF也用于阳性血培养中细菌分离株的鉴定。为进一步缩短周转时间，已开发出多种方案用于直接鉴定阳性血培养样本或短期培养（2–6小时）获得的微菌落。在人员短缺、预算有限和样本量增加的背景下，实验室需优化工作流程并实施自动化策略。MALDI-TOF在这些改进中扮演关键角色，尤其是在中型至大型微生物学实验室。目前全球微生物实验室使用的MALDI-TOF平台有多种，其中重要的两种是新VITEK MS PRIME（生物梅里埃）和MALDI Biotyper Sirius（布鲁克·道尔顿）。多项研究已证明两系统在鉴定厌氧菌、分枝杆菌、酵母和丝状真菌等广泛微生物方面具有高准确性。近期Thelen等人的一项时间比较研究在不同工作流程场景下对比了这两种仪器，突出了其性能因实验室规模和操作需求而存在的差异。

为理解这些仪器在具有中高通量鉴定需求的 urban 临床实验室中的附加价值，我们基于本地流行病学、快速鉴定方案和实验室组织，开展了一项比较两仪器性能、工作流程和可用性的研究。

MATERIALS AND METHODS

研究设计

研究在德国海德堡的MVZ Labor Dr. Limbach & Kollegen eGbR进行，旨在比较VITEK MS PRIME（VMP）和MALDI Biotyper Sirius（BS）系统的性能和工作流程效率。研究分为三个独立实验部分：第一部分使用来自琼脂培养的前瞻性和回顾性样本评估系统性能；第二部分比较短时培养（4–6小时）和长时培养（18–24小时）阳性血培养微菌落的鉴定准确性；第三部分进行工作流程分析，比较两设备的手动操作时间（HOT）和结果出具时间（TTR）。为排除操作者经验影响，前两部分研究由两名操作者（一名MALDI-TOF MS经验不足1年，另一名超过5年）执行，同一操作者对同一样本在两种系统上测试以确保可比性。

培养条件

前瞻性样本随机收集自多种样本类型（尿液、呼吸道、皮肤等）。回顾性分离株从-80°C储存复活。所有分离株在适宜培养基上于35°C至37°C培养（需氧菌18–24小时，厌氧菌24–48小时）。使用培养基包括含7%绵羊血的哥伦比亚琼脂（Oxoid）、补充PolyViteX的巧克力琼脂（生物梅里埃）和麦康凯II琼脂（BD）。阳性血培养样本在BD BACTEC FX自动化系统中于35°C培养。取一滴血培养液转种至哥伦比亚血琼脂（ThermoFisher Scientific）进行亚培养并在适宜条件下孵育。微菌落分别在孵育4–6小时和18–24小时后于两系统上分析。

样本制备

VMP系统使用VITEK PICKME笔制备靶板。用移液器在靶点上加1.0 µL饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液（溶于50%乙腈和2.5%三氟乙酸）。酵母分离株额外加0.5 µL 25%甲酸。每日按标准程序使用大肠杆菌ATCC 8739校准菌株进行仪器校准，该校准菌点样于VITEK MS-DS上三个指定位置。每日测试包含额外阳性和阴性对照。BS系统使用一次性接种环通过直接涂布将菌落应用于BS生物靶板（MBT Biotarget 96）的靶点，每点加1.0 µL IVD HCCA-基质（布鲁克）。酵母鉴定时加1 µL 70%甲酸。每个BS靶板上使用IVD Bacterial Test Standard（BTS）作为校准物。

研究第二部分对阳性血培养微菌落进行鉴定，比较使用和不使用甲酸处理的效果。

结果判读与不一致结果

使用VMP（软件版本1.1.2；IVD知识库V3.2）和BS系统（软件版本5.2.300；服务器版本4.1.100，MBT Compass Library 2023）平行鉴定每个分离株。VMP置信值≥99.9%为高置信鉴定，60%–99.8%为低区分度，<60%为无鉴定；BS log得分≥2.0为高置信鉴定，1.7–1.99为低置信，<1.7为无鉴定。未鉴定分离株用相应IVD软件重复测试一次，若仍无鉴定结果，则在RUO数据库中测试一次。多微生物培养被排除分析。

测序

为解决不一致鉴定结果，由BaseClear B.V.（荷兰）使用Illumina Novaseq 9000 PE150平台进行下一代测序（NGS）及在Life Technology AB3730XL仪器上进行桑格测序（16S-rDNA、tuf、rpoB、gyrB基因）。将相应分离株在血琼脂平板上培养并接种于Shield溶液（Zymo Research）后测序。使用FastANI算法（版本1.33）计算Illumina de novo组装查询基因组（目标菌株）与包含53,836个参考基因组的数据库之间的平均核苷酸一致性。参考基因组从NCBI基因组数据库检索，筛选条件为“细菌”，组装水平为“完整”或“染色体”，排除“非典型”。

工作流程分析

为比较两MALDI-TOF系统的工作流程，监测了包括靶板制备、干燥时间和靶板加载在内的HOT，并评估了包括系统测量在内的TTR。工作流程比较由两名操作者（一人操作VMP，一人操作BS）在一个工作日内完成，模拟Limbach实验室的常规工作流程。共制备16张靶板（每板16个点）并在两系统上依次（一张接一张）测量。每系统总计测量256个分离株，反映本实验室技术人员每日鉴定数量。比较所考虑的详细工作流程步骤见表1。

统计方法

鉴定率差异使用卡方检验分析。P值<0.05认为有统计学意义。使用GraphPad Prism 10.0版进行统计分析。

RESULTS

使用临床分离株的性能比较

共分析927株分离株（511株回顾性，416株前瞻性），代表219个不同物种。操作者经验水平对性能无影响。VMP获得885株（95.5%）鉴定结果，BS获得844株（91.1%）鉴定结果（P < 0.001）。VMP未鉴定出27株，BS未鉴定出68株；15株两系统均未鉴定。最终，817株分离株获得两设备平行鉴定结果，可直接比较鉴定一致性。其中437株（53%）为革兰阳性菌，350株（43%）为革兰阴性菌，30株（4%）为酵母。两系统在属和种水平的一致性分别为99.4%和97.5%。属水平不一致5株（0.6%），种水平不一致15株（1.8%）。对20株不一致样本进行测序，结果显示VMP错误鉴定10株（1.2%），BS错误鉴定11株（1.3%）。测序无法区分成团泛菌（Pantoea agglomerans）和败血症泛菌（Pantoea septica）。VMP和BS系统在不同细菌群和酵母中的性能表现见表2和表3，不一致结果详情见表4。整个研究中，操作者经验对准确性无影响。

短时与标准培养血培养的性能

孵育4–6小时后，未使用甲酸时VMP鉴定118株（99.2%），使用甲酸时鉴定113株（95.0%）；BS则分别为105株（88.2%）和110株（92.4%）。孵育18–24小时后，VMP正确鉴定119株（100%），BS鉴定118株（99.2%）。数据显示VMP在短时培养中结果显著更优（P < 0.001）。BS主要挑战在于鉴定革兰阳性菌，特别是葡萄球菌属物种（见表6）。

工作流程分析

从过程开始到最终鉴定的TTR，BS系统（155分钟）显著短于VMP系统（191分钟）。但VMP的实际HOT（106分钟）低于BS（155分钟）。VMP每鉴定分离株的HOT减半。VMP鉴定率高于BS（98% vs 82%；P < 0.0001）（表7和表8）。图2将完成运行数与时间轴对应绘制。每运行对应含16个样本点的靶板。蓝色条表示VMP完成运行，绿色条表示BS完成运行。阴影方块突出各设备HOT。图示表明BS处理每个靶板更快，但BS系统总HOT更长，如阴影方块所示。VMP上所有16张靶板可在1.5小时内加载完毕并由系统自动顺序处理，手动操作在09:30至11:00进行。而BS一次仅能加载一张靶板，导致手动过程更长，从09:30持续至11:45。BS有两张靶板因BTS采集重复失败未能分析，VMP所有靶板均成功采集。

DISCUSSION

本研究评估比较了MALDI-TOF系统VITEK MS PRIME（生物梅里埃）和MALDI Biotyper Sirius（布鲁克·道尔顿）在常规实验室设置中的鉴定率和工作流程效率。

两系统在219种不同细菌和真菌物种的广泛谱系中均展示高鉴定准确性，鉴定率分别为VMP 95.5%和BS 91.1%。这些结果与目前唯一比较Sirius和VITEK MS PRIME（布鲁克和生物梅里埃最新版MALDI-TOF系统）的Thelen等人研究一致。本研究中VMP系统92.3%样本达到高置信水平（>99%），BS系统78%样本得分≥2.0。与Thelen等人结果相比，VITEK MS PRIME结果相似（91.9%），但BS较低（95%）。这可归因于本研究方案：出现无鉴定（No ID）时，每分离株重测，若仍无鉴定则使用RUO数据库。此方法提高了VMP鉴定率，但对Sirius提升不显著。VITEK MS PRIME鉴定出而Sirius未鉴定出的分离株见表S1。此外，BS和VMP分析样本中分别有8.9%和4.5%未鉴定出微生物，高于既往发表水平（1.0%和1.6%）。未鉴定数较低可能因物种分布差异（主要为革兰阴性杆菌）及使用常规分离株而非本研究纳入的诊断挑战性样本。

在817株两系统均有配对鉴定结果的样本中，15株（1.8%）在种水平结果不一致，5株（0.6%）在属水平不一致。测序解析后，VMP在20例不一致中正确鉴定10例，BS正确鉴定9例，两仪器各有2例属水平错误鉴定（成团泛菌被VMP鉴定为致病杆菌属，被BS鉴定为克吕沃尔菌；罗尔斯通菌属被VMP和BS均鉴定为芽孢杆菌属）。最常见的种水平鉴定差异出现于几种葡萄球菌（如苏黎世葡萄球菌、溶血葡萄球菌、佩特拉斯葡萄球菌），以及单核细胞增生李斯特菌/无害李斯特菌和肺炎克雷伯菌/变栖克雷伯菌之间。这些物种亲缘关系近，质谱图谱高度相似，可能导致鉴定差异。葡萄球菌物种区分，特别是苏黎世葡萄球菌、溶血葡萄球菌和佩特拉斯葡萄球菌，仍具挑战性。即使测序，区分溶血葡萄球菌和苏黎世葡萄球菌也困难，因除16S rRNA基因外所有管家基因均相同。类似地，无害李斯特菌与单核细胞增生李斯特菌亲缘近，但对哺乳动物无致病性，此区分对准确诊断和患者管理具临床意义。此外，苏黎世葡萄球菌和佩特拉斯葡萄球菌致病性了解甚少，因这些物种近期才被描述。同样，变栖克雷伯菌鉴定临床微生物实验室不常规进行，其误判为肺炎克雷伯菌已有充分记录。需注意多数种水平不一致是已知的，并在两MALDI-TOF数据库使用说明中描述为局限性。总体，对于两仪器均鉴定的微生物，属和种水平一致性非常高。

对于短时培养血培养，孵育4小时后两系统性能差异显著，尤其无甲酸预处理时。对此类样本，VMP鉴定率高于BS系统，无论使用甲酸（95.0% vs 92.4%，P = 0.42）或不使用（99.2% vs 88.2%，P < 0.0001）。总之，结果表明血培养阳性后同日细菌鉴定可行。血流感染病原体快速鉴定临床关键，因允许早期启动靶向感染控制措施。基于短期亚培养的鉴定在超过80%病例中提供准确临床结果。与上述发现相反，Grohs等人报道血培养分离微菌落生长4小时后鉴定率较低，MBT和VMP系统鉴定率仅55.5%和70.2%。差异可解释为甲酸使用、仪器版本差异、可接受鉴定截断值降低及亚培养小时数不同。本研究中，添加甲酸仅对Sirius性能提升显著。但需注意，两制造商均不推荐血培养微菌落鉴定。布鲁克提出阳性血培养直接鉴定方案MBT Sepsityper Kit。近期生物梅里埃推出VITEK MITUBE，一种一次性样本制备装置，可直接从阳性BACT/ALERT血培养瓶快速鉴定革兰阴性微生物。综合考虑前瞻性临床和人工样本，VITEK MITUBE在声称物种中性能达95%。

本研究评估了两MALDI-TOF系统工作流程特性对其常规实验室程序适用性。BS从过程开始到最终鉴定的TTR（155分钟）显著短于VMP系统（191分钟）。但VMP实际HOT（106分钟）低于BS（155分钟）。BS一显著问题是反复出现BTS验证点检测困难，常需重复BTS点样，耗时且要求技术人员专程处理。虽VITEK MS PRIME校准物无问题，但需注意若校准物采集错误，采集组所有16个点需重新点样至另一采集组，而布鲁克系统仅需重新点样BTS。两设备一主要区别是VITEK MS PRIME新功能允许加载最多16张靶板至设备并顺序自动测量，这解释了VMP更短HOT（降低43%）和技术人员离机时间增加。此创新对实验室工作流程的优势也在其他研究中证实。对于仅处理少量靶板且在采集前制备大量点的实验室，Sirius系统可能更快。Thelen等人比较了Sirius与VITEK MS PRIME在三种场景下（一张95点靶板、一张47点靶板、四张16点靶板）的表现，显示当单张靶板处理大量分离株时Sirius系统具更短周转时间和手动时间，且使用靶板越多，两系统差异越小。此处我们通过使用VITEK MS PRIME系统最大容量（16张靶板）评估总时间节省，从而显示全过程所需HOT更低，为高通量、多工作台的大型实验室提供优势。

结论

本研究评估的两种MALDI-TOF系统在广泛物种鉴定中表现出极好的一致性。根据鉴定过程的实验室组织方式，两系统均适合高效工作流程，可灵活适应不同工作流程设置。但在测试条件下，VITEK MS PRIME展示出更优的工作流程效率。其连续“加载即运行”操作模式显著减少手动操作时间并提高通量，为全天处理鉴定任务的实验室提供明显优势。