龙泽宇|罗国富|陈雷|吴坤|常向兵|吴春涛|田伟
中国浙江省农林大学食品与健康学院，杭州
摘要
真菌细胞外多糖中的半乳甘露聚糖相关特性可能影响宿主的免疫反应。本研究从引起独活（Atractylodes macrocephala）菌核病的病原菌Sclerotium rolfsii中分离出四种细胞外多糖组分，并对其进行了多方法结构分析。通过监测与防御相关的生化指标（如水杨酸和过氧化氢的积累）以及过敏反应和程序性细胞死亡（PCD）表型来评估这些组分的诱导活性。其中，SR3组分表现出较高的半乳甘露聚糖侧链特征，能引发更明显的病斑形成和生长抑制，并导致更高的病害指数。总体而言，我们的数据支持Sclerotium rolfsii细胞外多糖中半乳甘露聚糖的含量与其在独活中引发的PCD反应强度之间存在关联，但尚未建立直接的因果关系或受体特异性。这些发现通过强调真菌细胞外多糖作为宿主防御反应（包括PCD表型）潜在调节因子的作用，拓宽了我们对植物-病原体相互作用的认识。
引言
真菌细胞壁是一种复杂的网状结构，由反复分支的多糖聚合物和蛋白质组成，在与植物的相互作用中起着关键作用。它是真菌与植物宿主细胞物理接触的主要界面[1]。大多数致病真菌具有主要由几丁质和β-葡聚糖构成的内层细胞壁，这些成分有助于维持细胞的结构完整性。相比之下，外层细胞壁的组成会根据细胞类型、环境条件和发育阶段动态变化。这一外层结构保护了内部的多糖，从而降低了它们被植物免疫系统识别的可能性[2]。
真菌病原体采用多种策略来隐藏其β-葡聚糖，以避免被宿主免疫系统识别。例如，Histoplasma capsulatum用α-葡聚糖掩盖其β-葡聚糖，而Paracoccidioides brasiliensis在宿主体内将β-1,3-葡聚糖转化为α-1,3-葡聚糖[3]。Aspergillus fumigatus也隐藏其β-葡聚糖；然而，这些病原体相关的分子模式（PAMPs）在孢子萌发或宿主缺氧条件下会暴露出来[4]。在该物种中，分生孢子利用hydrophobin RodA、α-葡聚糖、半乳胺基半乳聚糖和色素蛋白PskP进行表面掩盖，而菌丝主要依靠细胞壁基质中的半乳胺基半乳聚糖来隐藏表位[3][5]。由于许多真菌病原体会掩盖β-葡聚糖和其他免疫原性成分，因此细胞壁的动态重塑被认为可以增强其结构韧性[6][7]，同时也可能加剧宿主的免疫反应[1]。
尽管真菌与植物之间存在广泛的相互作用，但真菌如何重塑其细胞壁结构以抵御葡聚糖相关压力仍不甚明了。现有研究表明，真菌细胞壁的不同外层结构代表了物种对环境压力的特异性进化适应。这些外层结构通常限制了宿主对内层成分的接触。主要由甘露聚糖、α-葡聚糖、半乳胺基半乳聚糖和甘露蛋白组成的外层被认为可以保护内部的β-葡聚糖，使其免受植物模式识别受体（PRRs）的识别[8]。此外，这些外层结构可能与病原体发育或分化过程中产生的不完整细胞壁成分有关[1]。
我们之前报道过，从Sclerotium rolfsii菌丝中提取的细胞外多糖（EPS）具有强烈的免疫原性[9]。然而，这种效应具有浓度依赖性，需要达到最佳浓度才能发挥最大效果。相反，高浓度的EPS对独活具有有害影响[10]。本研究的核心问题是，这些有害效应是否与EPS中的细胞壁成分有关，可能是由于Sclerotium rolfsii在感染过程中细胞壁的动态变化所致。
Sclerotium rolfsii是一种土壤传播的坏死性病原体，可感染600多种植物，是多种作物南方枯萎病的致病菌[10]。早期的研究主要集中在Sclerotium rolfsii产生的细胞壁降解酶（CWDEs）和有毒代谢物草酸（OA）上[11][12]。然而，与其他真菌类似，人们对Sclerotium rolfsii在感染过程中细胞壁成分的动态变化关注较少。关于含甘露糖的多糖作为毒力因子的作用的研究也较少，除了它们在掩盖表位和维持细胞壁完整性方面的已知功能之外。最近的研究表明，致病真菌可以根据宿主信号改变其细胞壁组成，这可能导致宿主免疫反应的过度激活[3]。尽管如此，关于植物病原体在感染过程中细胞壁多糖（特别是半乳甘露聚糖）的有序组装的详细信息仍然匮乏。这些多糖在真菌细胞壁中的存在表明，病原体可能具有一种保守的机制来应对宿主的免疫挑战。
在本研究中，我们分析了从Sclerotium rolfsii中提取的细胞外多糖组分的组成和连接特性，并评估了它们对独活防御相关生理指标和表型的影响。研究结果表明，真菌细胞外多糖特性的差异与宿主反应的强度和持续时间有关。特别是，SR3组分中半乳甘露聚糖相关侧链特征的富集与独活中的过敏反应和PCD表型相关。这一发现扩展了之前关于半乳甘露聚糖在真菌细胞壁结构和潜在表面保护功能中的已知作用[3][13]。具体而言，半乳甘露聚糖相关侧链特征可能影响这些细胞外多糖组分中葡聚糖富集基序的呈现方式，从而调节宿主反应的强度和持久性。然而，当前的数据集无法确定多糖在植物组织中的可及性、吸收或定位，也无法识别涉及的宿主感知成分。因此，关于掩盖、误识别或感染策略等机制的解释仍属于假设，需要未来在受体水平和高分辨率结构上进行验证。总体而言，本研究提供了一个比较框架，将植物病原体的细胞外多糖特性与宿主防御结果联系起来，并通过强调真菌细胞外多糖作为宿主反应潜在调节因子的作用，拓宽了我们对植物-病原体相互作用的认识。
Sclerotium rolfsii（SR，ACCC 37946）购自中国农业微生物菌种保藏中心。该真菌在30°C下培养于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养皿中。培养后，用蒸馏水洗涤菌丝以供进一步使用。
菌丝在120°C高压蒸汽下灭菌20分钟，然后离心收集沉淀物。通过将菌丝浸泡在丙酮中30分钟去除内毒素，随后再次离心。
从Sclerotium rolfsii中纯化四种细胞外多糖组分
在真菌与植物相互作用过程中，多糖主链连接方式的改变以及侧链取代模式的变化可以调节宿主对微生物多糖的防御反应[19]。也有研究表明，糖残基组成的变化会影响含β-葡聚糖制剂的诱导活性。本研究旨在探讨Sclerotium rolfsii的细胞外多糖组分在碳水化合物特征上的差异及其相关效应。
在本研究中，Sclerotium rolfsii不同细胞外多糖组分之间的半乳甘露聚糖组成差异伴随着独活中防御相关指标和表型的差异。含有较高甘露糖和半乳糖侧链特征的组分（尤其是SR3）与更明显的过敏反应和PCD表型相关，包括持续的水杨酸和过氧化氢积累以及更高的病害指数。
强泽宇：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、可视化、软件使用、数据分析、数据管理。
罗国富：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、软件使用、方法学设计、概念构建。
陈雷：撰写、审稿与编辑、概念构建。
吴坤：撰写、初稿撰写、软件使用、方法学设计、数据管理。
常向兵：方法学设计、数据管理。
吴春涛：初稿撰写。
田伟：项目监督、资源提供。
本研究未获得任何资助机构的财务支持。
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
我们感谢浙江省农林大学食品与健康学院的协助和支持。作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。所有语言编辑工作均使用基于人工智能的工具完成，所有科学内容、数据解释和结论均由作者独立生成和验证。
