王飞|雷宇豪|陈梦涵|毕海曦|罗雅媛|白芳芳|林华|陈焕春|何启盖|吴斌|彭忠
中国农业大学兽医学院农业微生物学国家重点实验室，中国武汉430070
摘要
多杀性巴氏杆菌毒素（PMT）是由某些人畜共患呼吸道病原体多杀性巴氏杆菌（P. multocida）产生的关键毒力因子。PMT在诱导呼吸道上皮细胞损伤和凋亡中的作用仍不清楚。在这项研究中，我们探讨了PMT通过何种分子机制诱导猪气管上皮细胞（NPTr）的凋亡。研究发现，高浓度的PMT特异性地诱导caspase-3依赖性凋亡，而其突变形式则没有这种效应。机制分析表明，PMT通过内质网（ER）应激相关的PERK通路激活NF-κB信号通路，显著上调死亡受体5（DR5）的表达，进而激活caspase-3，触发凋亡。关键验证实验表明，敲除编码DR5的基因TNFRSF10B几乎完全抑制了PMT诱导的凋亡，并显著恢复了细胞活力。总之，本研究确定了PERK–NF-κB–DR5信号轴是PMT诱导猪气管上皮细胞凋亡的主要调控通路。
引言
多杀性巴氏杆菌是一种人畜共患的革兰氏阴性病原体，对兽医和公共卫生都具有重要意义。在猪和其他哺乳动物中，多杀性巴氏杆菌感染主要通过呼吸道发生，导致呼吸道疾病是最常见的临床表现（Wilkie等人，2012年）。然而，它还可能导致脑膜炎、血液感染、附睾炎，甚至致命后果（Wilson和Ho，2013年；Miguélez-Pérez等人，2024年；Namba等人，2025年）。这部分归因于多杀性巴氏杆菌破坏哺乳动物呼吸道上皮屏障的能力，从而使其进入血液并扩散到呼吸系统以外的多个器官（Lin等人，2023年）。因此，呼吸道上皮屏障的破坏是多杀性巴氏杆菌发病机制中的一个关键步骤，需要进一步研究其潜在机制。多杀性巴氏杆菌毒素（PMT）被认为是该细菌最重要的毒力因子之一，存在于D型和A型血清型的部分菌株中（Peng等人，2019年）。PMT的生物学效应的核心机制依赖于其在宿主细胞中异三聚体G蛋白α亚基（Gα）的共价修饰和激活。先前的研究表明，PMT可以特异性地靶向Gαq/11、Gα12/13和Gαi亚家族的成员（Orth和Aktories，2012年；Orth和Aktories，2010年；Babb等人，2012年）。PMT通过特定谷氨酰胺残基的脱酰胺作用激活Gα亚基，从而激活多个下游信号通路，调节多种细胞过程，包括细胞骨架动态（Bi等人，2025年）、细胞增殖（Kloos等人，2015年；Oubrahim等人，2012年）、免疫反应（Hildebrand等人，2012年）以及细胞死亡的调控（Preuß等人，2010年；Xiao等人，2023年；Yuan等人，2024年）。我们最近的研究表明，PMT处理通过激活RhoA/ROCK信号通路导致哺乳动物呼吸道上皮屏障的破坏，进而引起细胞骨架重组和紧密连接及黏附连接的减少（Bi等人，2025年）。这一过程涉及PMT与CaV3.1的相互作用，后者诱导细胞质Ca2+内流并破坏细胞内Ca2+稳态，从而引发内质网（ER）应激。值得注意的是，在实验的后续阶段观察到了促凋亡效应，尽管此前有报道指出PMT是强效的抗凋亡诱导剂（Preuß等人，2010年）。为了解释这一明显的矛盾，我们使用NPTr细胞作为模型进行了进一步研究，发现PMT具有浓度依赖性的促凋亡效应。机制上，高浓度的PMT激活PERK通路，进而调节下游NF-κB通路，上调TNFRSF10B（编码DR5）的转录，最终触发Caspase-3依赖性凋亡。重要的是，敲除TNFRSF10B基因几乎完全抑制了PMT诱导的凋亡，并显著恢复了细胞活力，证实DR5在猪呼吸道上皮细胞中对此过程至关重要。本研究揭示了通过PERK–NF-κB–DR5信号级联介导的PMT毒性新机制，为理解多杀性巴氏杆菌的发病机制提供了理论基础。
部分内容
细胞系、细菌菌株和培养条件
多杀性巴氏杆菌 HN06（GenBank登录号：CP003313）是一种产PMT的D血清型菌株，从中国海南省一只患有进行性萎缩性鼻炎的猪的鼻拭子中分离得到。该菌株在添加了5%新生牛血清（Tianhang，杭州，中国）的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）或胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）（Becton, Dickinson and Co., Spark，美国）中培养。大肠杆菌菌株在液体Luria-Bertani（LB）培养基或Luria-Bertani琼脂（LA）平板上生长。PMT诱导的凋亡是细胞死亡的关键机制
PMT的催化活性依赖于第1165位（C1165）的半胱氨酸和第1205位（H1205）的组氨酸（Yuan等人，2024年；Orth等人，2003年）。在这项研究中，构建了一个双位点突变体（C1165S/H1205A）以完全消除PMT的毒性。测序确认toxA基因及其突变版本已正确插入pET30a载体中（图S1A、S1B、S1C）。重组质粒被转化到大肠杆菌中，成功表达了带His标签的蛋白。
讨论
作为多杀性巴氏杆菌最重要的毒力因子之一，PMT已被发现具有广泛的细胞效应并能够诱导细胞死亡（Banu等人，2020年）。其诱导宿主细胞损伤的分子机制需要深入研究。本研究以NPTr细胞为模型，首次系统地阐明了PMT通过调控凋亡导致呼吸道上皮损伤的具体机制。
CRediT作者贡献声明
毕海曦：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、数据管理。雷宇豪：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、研究、数据管理。陈梦涵：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、数据管理。彭忠：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金争取、概念构思。王飞：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写，
致谢
本研究得到了中国自然科学基金（项目编号32522104）、湖北省自然科学基金（项目编号2023AFA094）、中央高校基本科研业务费（项目编号2662025DKPY004）、英子科技与华中农业大学食品健康智能研究院（项目编号IRIFH202209）、沃尔玛基金会（项目编号61626817）以及湖北洪山实验室与华中农业大学创业基金的资助。资助方对研究结果没有
