多胺对凝血酶诱导的人类血小板激活和氧化应激的调节作用

多胺显著抑制凝血酶诱导的血小板聚集、CD62P暴露及钙信号上升，并通过抗氧化作用减少脂质过氧化，恢复线粒体氧化磷酸化效率，精胺效果最显著，提示其治疗血栓相关心血管疾病的潜力。

Maria Grazia Signorello

意大利热那亚大学药学系，生物化学实验室，热那亚16132

摘要

本研究探讨了三种多胺——精胺、亚精胺和腐胺——对凝血酶诱导的血小板激活和功能的影响。研究结果表明，多胺显著影响血小板活性，其中精胺的作用最为显著。多胺能够以剂量依赖的方式抑制凝血酶引起的血小板聚集和CD62P表达，以及细胞内钙浓度的升高，这表明多胺参与了血小板激活的信号通路。除了对血小板功能的影响外，多胺还具有较强的抗氧化活性。在凝血酶刺激的血小板中，多胺（尤其是精胺）能够抑制活性氧和超氧阴离子的产生，以及随之而来的脂质过氧化，从而发挥抗氧化应激的作用。此外，多胺通过提高氧化磷酸化效率来恢复线粒体功能。多胺还能恢复氧消耗率和ATP的产生，表明其在促血栓形成条件下维持细胞能量稳态中的作用。这些发现表明，多胺（尤其是精胺）可能具有潜在的治疗作用，因为它们可以调节血小板激活、氧化应激和氧化磷酸化效率。通过多胺治疗恢复血小板功能可能对预防静脉和动脉血栓形成（这些血栓形成与心血管疾病相关）具有保护作用。

引言

多胺（PA）包括精胺、亚精胺和腐胺（图1），它们由L-鸟氨酸或某些氨基酸脱羧生成[1]、[2]。哺乳动物细胞中的多胺浓度达到毫摩尔级别，其发现和合成可追溯到17至20世纪[3]。从化学性质上看，多胺是有机聚阳离子烷基胺，带正电荷的氨基数量影响其活性，精胺由于含有四个氨基而具有很高的活性[4]。多胺在多种生化过程中发挥关键作用，如核酸和蛋白质合成[5]、细胞信号传导、DNA结合、转录、RNA剪接、细胞骨架功能以及翻译起始[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。在生物学上，多胺及其类似物与人类健康和疾病的多方面相关，包括胃肠病学、肿瘤学、氧化应激、脑卒中、寄生虫学、细胞凋亡、肥胖和哮喘[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。已有研究表明，许多胺类物质能够抑制内源性凝集素的凝集活性以及不同激动剂引起的血小板聚集[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。然而，它们的作用机制尚不清楚。一种提出的机制是多胺通过破坏血小板间的连接来抑制聚集[26]。这种抑制作用似乎与诱导聚集的激动剂无关，并且多胺的抑制效果比相应的单胺更强[26]。另有研究认为，胺类物质可能影响激动剂诱导激活过程中纤维蛋白原与血小板表面的结合[27]、[28]。Israels等人[29]报告称，精胺可通过干扰纤维蛋白原结合来阻断血小板间的相互作用，并抑制凝血酶与其受体和/或底物的结合，从而干扰凝血酶诱导的血小板激活信号传导。最近的研究还发现，血小板在Ca²⁺离子载体刺激下以及凝血酶生理激活过程中会释放亚精胺[30]。活性氧（ROS），包括自由基和非自由基形式的氧（如超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基），是需氧代谢的天然副产物，会在多种激活因子作用下以及需氧代谢过程中产生[31]。已知凝血酶会诱导ROS的产生[32]、[33]，这容易导致氧化应激。凝血酶还能激活多种产生ROS的酶，如NADPH氧化酶[34]，以及线粒体和微粒体的电子传递链[35]。ROS调节着生理和病理过程中的信号通路[36]、[37]。在暴露于ROS的静息血小板中，超氧阴离子或过氧化氢水平显著升高[38]、[39]、[40]。此外，ROS还会促进血小板过度激活和血栓形成[41]。因此，我们研究了精胺、亚精胺和腐胺对凝血酶刺激的血小板的影响。选择凝血酶作为研究对象，为我们提供了一个评估多胺及其对经典且具有临床意义的血小板激活通路影响的独特机会；但由于未评估其他主要通路（包括胶原-GPVI信号通路），我们的抗血小板研究结果的可推广性受到限制。因此，需要进一步研究多胺对其他血小板激动剂的反应。在这项初步研究中，我们分析了多胺对血小板激活和氧化状态相关指标的影响，包括测量超氧阴离子的产生、脂质过氧化和NADPH氧化酶活性。同时，我们还通过测量ATP合成和氧消耗率来评估它们对需氧代谢效率的影响。

材料

ADP、氨苄西林、阿普拉酶、牛血清白蛋白、丁基羟基甲苯、细胞色素C、二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、二腺苷-5′-五磷酸、洋地黄毒苷、二硫苏糖醇（DTT）、乳酸测定试剂盒、亮肽素、苹果酸、乌头碱、甲醛、PGE₁、苯甲基磺酰氟（PMSF）、蛋白酶抑制剂混合物（目录编号P8340）、丙酮酸、超氧化物歧化酶（SOD）、腐胺、精胺、亚精胺、琥珀酸、硫代巴比妥酸（TBA）、凝血酶以及所有实验用化学品均来自……

人类血小板聚集、CD62P表达和[Ca²⁺内流检测

已知多胺能够抑制血小板聚集[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。因此，我们的首要目标是验证精胺、亚精胺和腐胺是否能在实验条件下抑制凝血酶诱导的血小板聚集。如图2A所示，这三种多胺均能抑制血小板聚集。其中精胺的效果略优于亚精胺和腐胺，其在凝血酶刺激的血小板中的IC₅₀值分别为5.81 ± 0.30、7.49 ± 0.35……

讨论

精胺、亚精胺和腐胺是多胺，它们在细胞周期调控、蛋白质合成和DNA稳定等细胞过程中发挥关键作用[8]、[9]、[10]、[11]。血小板对于血管修复和血栓形成至关重要，其生理功能的维持依赖于细胞内信号传导的精确调控[51]、[52]。多项研究表明，多胺能够抑制血小板……

结论

精胺、亚精胺和腐胺能够调节血小板功能，包括聚集、钙信号传导、氧化应激和线粒体氧化磷酸化。其中，精胺的作用最为显著，这突显了其作为血小板激活和氧化损伤强效调节剂的潜力。这些发现表明，多胺可能在过度血小板激活和血栓形成过程中发挥保护作用。

CRediT作者贡献声明

Maria Grazia Signorello：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、实验设计、方法学研究、资金获取、数据分析、概念构思。

资助

意大利教育、大学与研究部，FRA 2023项目资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

线粒体功能检测（氧化分析及Fo-F1 ATP合成酶活性评估）由意大利热那亚大学实验医学系的Silvia Ravera教授完成，联系方式：[e-mail]。