在真核细胞的核仁中，液-液相分离形成的凝聚环境被认为通过“分子伴侣”作用促进rRNA的正确折叠，并通过对核糖体组装因子的空间分选优化组装过程。然而，凝聚态核仁内部的微观相互作用如何影响rRNA折叠和组装，至今仍不清楚。这其中的一个核心矛盾在于：许多参与相分离的RNA结合蛋白（如富含内在无序区域的蛋白）同时具备特异性参与RNA加工或组装的功能，其特异性与非特异性作用在凝聚环境中难以剥离。核仁作为核糖体合成的工厂，其高效运作机制是生命科学领域的重大挑战之一。
为了揭示这一谜题，研究人员选择了一个关键模型——来源于嗜热四膜虫的自剪接I型内含子的L-21核酶，以及大肠杆菌16S rRNA的五向连接结构域（5WJ）。他们利用全内反射荧光显微镜（TIRF）技术，实时监测了这些RNA模型在Nop1/fibrillarin（核仁的主要组成蛋白之一）液滴内外的折叠动态。结果显示，无论是在稀释相还是凝聚相中，Nop1均能平等地 destabilize 核酶底物螺旋的三级结构停靠，且该效应仅依赖于Nop1与核酶之间的瞬时分子相互作用。
研究团队发现，Nop1的结合还会抑制DEAD-box解旋酶（如CsdA）对rRNA的解折叠活性，并阻碍核糖体蛋白的非特异性结合。更有趣的是，随着时间的推移，与Nop1的非特异性相互作用会被特异性的RNA-蛋白质组装过程所竞争性取代。这些发现清晰地描绘了驻留在核仁内的RNA结合蛋白如何“微调”RNA折叠稳定性的平衡，同时允许天然核糖体复合物的顺利组装。
在技术方法上，本研究主要依托单分子荧光共振能量转移技术，在体外重构了Nop1与tRNA形成的相分离液滴体系，并利用荧光漂白恢复技术验证了液滴的流动性。通过实时监测单个RNA分子的FRET效率变化，定量分析了Nop1对RNA构象动力学的影响，并利用蛋白片段缺失突变体明确了其GAR结构域的关键作用。
研究结果
Nop1通过其GAR结构域非特异性结合RNA并破坏P1螺旋停靠
通过对比全长Nop1及其不同结构域片段（GAR-BCO和BCO-MD）的作用，发现仅包含GAR结构域的片段即可有效破坏L-21核酶P1螺旋的停靠，而缺失GAR结构域的片段则无此效应。单分子共定位实验进一步证实，全长Nop1及GAR-BCO片段可与RNA发生短暂结合（≤5秒），而BCO-MD片段几乎不结合。这表明Nop1通过其富含精氨酸-甘氨酸的GAR结构域与RNA发生非特异性相互作用，进而干扰RNA的高级结构形成。
Nop1不破坏RNA二级结构但干扰三级结构
针对仅包含P1螺旋茎环结构的RNA hairpin进行smFRET实验，发现Nop1处理并未引起其FRET效率的显著变化，而已知的RNA解旋酶CsdA则可有效解旋该结构。这表明Nop1并不直接破坏RNA的稳定二级结构（如双螺旋），而是特异性地干扰需要三级相互作用（如螺旋停靠）才能形成的复杂空间结构。
特异性核糖体蛋白组装可竞争性取代Nop1的非特异性结合
在16S rRNA的5WJ模型系统中，当加入其特异性结合蛋白uS4后，Nop1在RNA上的占据率显著降低；而加入非特异性结合蛋白uS7则无此效果。反之，Nop1的存在并不影响uS4与5WJ rRNA的特异性结合。这证明，正确的、高亲和力的核糖体蛋白-RNA组装可以有效地排斥Nop1的非特异性结合，从而保证核糖体组装过程的有序进行。
Nop1保护rRNA免受DEAD-box解旋酶的过度解折叠
在ATP存在的条件下，DEAD-box解旋酶CsdA可迅速解折叠5WJ rRNA，使其从高FRET状态转变为低FRET状态。然而，当Nop1存在时，CsdA对rRNA的解折叠作用受到明显抑制。即使预先用CsdA将rRNA解折叠，再加入Nop1与CsdA的混合物，rRNA仍能部分恢复其折叠状态。这表明Nop1的非特异性结合在一定程度上起到了“分子缓冲”的作用，防止ATP依赖的解旋酶对rRNA进行过度解折叠，可能为正确的折叠路径提供了更宽松的时间窗口。
讨论与意义
本研究通过精巧的单分子实验证明，核仁蛋白FBL/Nop1通过其无序的GAR结构域与RNA发生瞬时、非特异性的相互作用，这些微观相互作用本身（而非其导致的宏观相分离）是调控RNA折叠稳定性和RNP组装进程的关键。这种作用机制可能具有普遍性，因为许多核仁蛋白含有类似的RGG重复 motif。
研究发现，适度的RNA去稳定化可能通过帮助解决错误折叠的RNA构象来加速核糖体组装。另一方面，特异性组装因子的结合可以有效地将Nop1等“分子伴侣”从pre-rRNA上置换下来，这为理解成熟核糖体如何从核仁凝聚相中被“排出”提供了热力学解释。此外，Nop1对解旋酶活性的调节作用提示，核仁环境可能通过平衡各种RNA结合蛋白的活性，确保rRNA在折叠“可塑性”与结构“稳定性”之间达到最佳平衡，从而高效完成核糖体组装这一复杂过程。
该工作将相分离研究从宏观形态学推进至单分子水平的微观相互作用研究，强调了在理解生物分子凝聚体功能时，区分宏观相分离现象与微观分子相互作用的重要性。论文发表于《Nucleic Acids Research》，为深入探索核仁的组装机制及其他RNP颗粒的功能原理提供了新的研究范式和重要理论基础。
