引言
痛觉感知始于外周伤害性刺激被背根神经节（DRG）中的伤害性感受神经元检测并传递。尽管动物模型在痛觉研究中贡献显著，但物种间在转录组、解剖结构和电生理等方面的差异限制了其临床转化价值。因此，建立人类体外痛觉模型对疼痛治疗药物的开发至关重要。HD10.6细胞系作为人DRG来源的永生化神经元，具有分化为感觉神经元的潜力，但其痛觉特性尚未系统评估。本研究旨在全面表征HD10.6细胞的伤害性信号特征，并将其发展为研究人类痛觉信号与治疗的工具。
材料与方法
细胞培养与分化：HD10.6细胞在含纤维连接蛋白的培养基中增殖，并通过添加多西环素及神经营养因子（如NGF、GDNF）诱导分化。分化后的细胞用于后续实验。
免疫荧光染色：细胞固定后，使用针对NF200、TRPV1、NaV1.7、CGRP、P物质、NK1R及MOR等蛋白的抗体进行标记，通过共聚焦显微镜观察蛋白表达与定位。
钙成像：利用Fluo-4 AM钙指示剂，记录细胞在辣椒素（TRPV1激动剂）、OD1（NaV1.7激动剂）及炎症混合物（含缓激肽、PGE2、5-HT、ATP和组胺）刺激下的钙内流动态。
膜片钳记录：通过全细胞膜片钳技术记录分化细胞的静息膜电位、阈值电流、动作电位发放模式及钠/钾电流密度，评估其电生理特性。
微流控室与AAV转导：将细胞培养于双室微流控装置中，模拟神经元胞体与周围端解剖结构。在周围端室添加AAV9-mCherry病毒，评估其摄取与转运效率。
结果
关键离子通道的表达与功能：分化后的HD10.6细胞表达痛觉相关离子通道TRPV1和NaV1.7，且定位于胞体与轴突。钙成像显示，辣椒素和OD1可分别引发显著的钙内流，证实通道功能活性。
电生理特性：分化细胞呈小直径神经元形态（胞体短轴16.2 μm，长轴22.5 μm），电容约19.3 pF，膜电阻高达1328 MΩ。静息膜电位为-49.5 mV，阈值电流约111 pA，多数细胞（92%）呈单次动作电位发放，少数（8%）为多次发放。电压钳记录到钠电流密度平均为62.5 pA/pF。
神经肽与受体表达：细胞表达伤害性神经肽CGRP和P物质，及其受体NK1R，提示其具备神经源性炎症调节潜力。
阿片镇痛信号：分化细胞表达MOR蛋白，μ受体激动剂DAMGO可抑制KCl诱发的钙内流，且此效应可被纳洛酮逆转，表明功能性阿片信号通路的存在。
炎症诱导的外周敏化：短期炎症混合物（IS）暴露直接引发钙内流；4小时预处理后，细胞对KCl的反应性增强，表现为钙内流幅度升高、响应细胞比例增加。电生理记录显示，IS处理使静息膜电位去极化、阈值电流降低、钠电流密度倍增，模拟了痛觉敏化状态。
微流控室中的基因治疗模拟：在微流控装置中，HD10.6细胞的轴突可穿越微沟槽生长。周围端室施加AAV9-mCherry后，病毒可被摄取并逆行转运至胞体，实现mCherry表达，为周围给药策略提供实验依据。
讨论
本研究系统验证了HD10.6细胞作为人类伤害性感受神经元的代表性：其表达关键痛觉分子，具备电兴奋性，可模拟炎症性疼痛状态，并适用于基因治疗研究。与人类原代DRG神经元及iPSC来源痛觉神经元相比，HD10.6细胞在尺寸、电生理参数等方面具有可比性，且无需漫长分化过程。值得注意的是，分化过程中避免使用福斯高林（forskolin）可防止细胞过度去极化，保障模型可靠性。通过微流控室模拟神经元空间结构，为研究痛觉信号区室化及靶向给药提供了新平台。
结论
HD10.6细胞系是一种可靠的人类痛觉研究模型，能够模拟伤害性信号的启动、持续及治疗干预。其在外周敏化与基因载体递送方面的应用潜力，为疼痛机制探索与药物开发提供了高效工具。
