自旋介导和质子耦合的电子转移增强了双原子金属酶类NADH氧化酶的活性

NAD+再生的人工酶系统通过自旋调控与质子耦合电子转移机制实现高效催化，在模拟炎症环境中催化效率达0.99 μM−1·min−1，超自然酶9-99倍，且在皮肤伤口模型中显示持续抗炎再生效果。

Jiarong Li|Yonghui Li|Zhen Wan|Hongyang Li|Haitao Dai|Changlong Liu|Xiaoyu Mu|Xiao-Dong Zhang

天津大学医学工程与转化医学研究院脑科学与神经工程重点实验室，中国天津300072

摘要

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）作为一种关键的辅酶，在多种炎症性疾病的发病机制中起着核心作用。然而，无论是天然的还是人工合成的NADH氧化酶（NOX）系统，在NAD⁺的再生方面都表现出有限的效果。在这里，我们通过自旋介导和质子耦合电子转移（PCET）机制，开发出一种具有超自然NOX活性的RuCo异质双原子金属酶（DAMs）。在模拟的炎症微环境中，DAMs的催化效率（K_{cat/Km）达到0.99 μM⁻¹min⁻¹，比报道的人工酶高出约9–99倍。此外，其定量NOX活性达到2139 U/mg，是常见微生物酶的6–18倍。实验和计算研究表明，Co不仅将Ru的自旋状态从低自旋调节为中间自旋，而且其亲电微环境促进了氧的吸附，进一步调节了高自旋Ru的电子行为。因此，Ru-Co-O作为高活性位点，能够通过PECT机制从NADH中捕获电子和质子。在皮肤损伤模型中，DAMs通过恢复NAD⁺/NADH比率、增强能量代谢以及驱动巨噬细胞的抗炎极化，从而减轻炎症并促进皮肤再生。值得注意的是，治疗后20天内未观察到复发现象，这突显了DAMs的持久治疗效果。}

引言

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是生物体内不可或缺的辅酶，其缺乏与多种重大人类疾病的发病机制和进展密切相关，包括神经退行性疾病、代谢综合征、动脉粥样硬化和自身免疫性疾病[1]、[2]、[3]、[4]。天然的NADH氧化酶（NOX）和血红蛋白在NAD⁺再生途径中表现出显著的催化潜力[5]。目前，这些天然酶的主要来源是从特定细菌（如乳杆菌、链球菌、肠球菌属）中提取[6]。然而，提取过程不仅复杂且成本高昂，而且获得的天然酶存在稳定性差和长期储存困难等固有缺陷[7]、[8]。相比之下，具有可调催化活性、功能多样性、高稳定性、易于储存和较低生产成本的人工酶有望成为天然NOX的强大替代品，为NAD⁺再生及相关疾病治疗提供新的可行途径[7]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。

尽管在开发具有NOX类似催化活性的人工纳米酶方面取得了显著进展，但其催化效率仍有进一步提高的空间。在自然界中，非血红素铁金属酶利用双氧生成高自旋Fe(IV)=O中间体以实现高催化性能，例如普遍存在的α-酮戊二酸依赖性双氧酶。受生物学启发，Hou等人开发了一种含有活性高自旋铁(IV)-氧基位的金属有机框架，通过双氧激活实现催化氧化[14]。Yang等人通过Mn掺杂将Fe位点的自旋状态从低自旋（t_2g^{5e_g0）调节为中间自旋（t_2g4e_g1），从而促进氧还原[15]。这些研究表明，通过配位环境调控自旋状态是提高酶类催化效率的有效策略[16]、[17]、[18]、[19]。同时，质子耦合电子转移（PCET）是天然氧化还原酶系统中的关键机制，显著增强了生物催化性能[20]、[21]、[22]。特别是过渡金属复合物（M-N_x）根据其配位环境表现出特定的质子反应性和PCET模式[23]、[24]。在电子转移过程中，过渡金属复合物内的自旋相互作用会显著影响PCET途径[25]、[26]、[27]、[28]。因此，深入理解和控制人工金属酶中的自旋介导和PECT途径是生物催化剂开发领域的关键焦点。}

在这项工作中，我们开发了一种RuCo异质双原子金属酶（DAMs），通过自旋调控和PCET机制的协同作用，实现了超越天然酶的NOX类似活性（图1a）。在模拟的炎症微环境条件下，DAMs的催化效率（K_{cat/Km）为0.99 μM⁻¹·min⁻¹，其定量NOX活性达到2139 U/mg，远超报道的人工酶和常用的微生物酶。超导量子干涉装置（SQUID）结果和密度泛函理论（DFT）计算表明，Co的加入不仅促进了Ru自旋状态从低自旋向中间自旋的转变，还通过调节其亲电微环境优化了高自旋Ru的电子行为，从而促进了O2的吸附。Ru-Co-O作为高活性位点，在酸性条件下通过PCET机制有效捕获NADH中的电子和质子，实现了高效的NAD⁺再生（图1b）。体内实验进一步证明，DAMs通过恢复NAD⁺/NADH比率、改善能量代谢以及驱动巨噬细胞的抗炎极化，促进了组织修复，并且没有观察到复发现象。这项工作开创了将自旋状态调控和PCET机制整合到人工酶设计中的先例，为开发高效生物启发型催化系统提供了新策略。}

部分摘要

DAMs的结构表征

DAMs的制备采用两阶段工艺：首先进行水热合成，然后进行热解。透射电子显微镜（TEM）成像显示，这些材料具有非晶态、片状形态（图S1），N、Ru和Co元素均匀分布在类石墨层状结构中（图S2）。利用像差校正的高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（AC-HAADF-STEM）技术

结论

在这项研究中，我们通过自旋状态调控和PCET机制，证明了RuCo异质DAMs具有超越天然酶的显著NOX类似活性。在NOX类似过程中，首次发现了三种协同增强因子：O₂、H₂O₂和H⁺。值得注意的是，DAMs实现了前所未有的催化效率（K_{cat/Km）为0.99 μM⁻¹ min⁻¹，以及2139 U/mg的定量活性，优于现有的合成酶和微生物酶}

材料制备

DAMs的制备分为两个步骤：

第一步，从含有4 g芘和320 mL 70 %硝酸的水溶液中合成三硝基芘，温度为95℃。随后，将0.1 g合成的三硝基芘溶解在10 mL 2.5 %氨水中，通过冰上超声处理确保均匀分散。将溶液转移到聚四氟乙烯衬里的反应器中，并在180℃下加热

作者贡献声明

我们在此声明本手稿是原创的，之前未发表过，也未在其他地方接受审稿。我们确认所有署名作者均已阅读并批准了该手稿，作者名单反映了所有实质性贡献者，并且所有合作者已就作者顺序达成一致。

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CRediT作者贡献声明

Hongyang Li： 软件开发。Yonghui Li： 初稿撰写。Zhen Wan： 项目管理。Zhang Xiaodong： 资金筹集。Jiarong Li： 初稿撰写、验证、软件开发、数据管理。Xiaoyu Mu： 写作、审稿与编辑、监督、研究、资金筹集。Haitao Dai： 项目管理。Changlong Liu： 资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了青年科学家A类基金（原国家杰出青年科学基金）（项目编号82525035）、国家自然科学基金（项目编号82572397、U24A6012、91859101、81971744、U1932107、82302361、82302381、62205242、U22A20349）、天津市杰出青年基金（2021FJ-0009）、天津市自然科学基金（编号25JCYBJC01530、23JCYBJC00710、24JCZDJC01270）和天津市科技计划的财政支持