在许多疾病的早期阶段，传统的诊断指标往往无法显示出明确的迹象，而尿液中的miRNA能够敏感地捕捉到疾病的微妙信号[1]、[2]。例如，当肿瘤发展时，癌细胞释放的特定miRNA进入血液并通过肾脏进入尿液[3]。在通过影像学或蛋白质标志物检测到任何变化之前，某些miRNA的组合就已经表现出异常表达，为早期癌症筛查提供了机会[4]。在膀胱癌中，某些miRNA在出现血尿症状之前就已经上调，这有助于提高患者的生存率和治愈的可能性[5]。此外，不同疾病亚型以及个体患者之间的差异显著，使得尿液中的miRNA成为精确分类和预后评估的关键线索。肾细胞癌的不同亚型具有不同的分子机制，每种亚型都有独特的尿液miRNA表达谱[6]。这使得能够进行准确分类，帮助医生选择个性化的治疗策略。在心血管疾病中，特定miRNA的水平与心肌梗死患者的 myocardial injury 和恢复预后相关[7]。除了肿瘤学和心脏病学之外，尿液中的miRNA谱型在神经发育障碍中也显示出实用性，例如它们作为诊断Hirschsprung病（HSCR）的非侵入性生物标志物的潜力，这可能减少对侵入性直肠吸痰活检的依赖[8]。动态监测尿液中的miRNA可以评估疾病进展和治疗反应，指导康复计划的定制。尿液收集是非侵入性的、无痛的，并且可以频繁进行，因此更受患者欢迎，便于持续监测疾病动态[9]。与侵入性且难以重复的组织活检以及受多种因素影响的血液检测相比，尿液检测避免了这些风险和不便[10]、[11]。它可以降低成本，并提高慢性疾病管理和大规模人群筛查的依从性。例如，在糖尿病肾病的早期筛查中，定期检测尿液中的miRNA有助于早期控制病情并延缓肾衰竭[12]、[13]、[14]。最近，纳米技术实现的miRNA富集技术结合基于机器学习的生物信息学分析，使得能够全面分析尿液中的miRNA，并证明了其在早期癌症检测中的高诊断准确性[15]、[16]。除了诊断之外，miRNA在疾病途径中的功能作用表明，发现的尿液miRNA特征还可以为靶向干预措施的开发提供信息，完成从生物标志物发现到治疗的转化循环[17]。然而，由于miRNA是分子量小、丰度低且序列相似性高的小分子[18]，对检测技术的灵敏度和特异性有严格的要求，这对检测方法的特异性、灵敏度和时效性提出了新的挑战。
目前，在尿液miRNA检测领域，主要技术包括定量逆转录PCR（qRT-PCR）[19]、微阵列技术[20]、下一代测序（NGS）[21]和核酸等温扩增技术[22]、[23]。其中，RT-PCR被认为是miRNA检测的金标准，因为它具有高灵敏度，可以精确检测低丰度的miRNA，适用于早期疾病筛查[24]。然而，它操作复杂、耗时且容易受到样本杂质的影响。样本处理需要多个纯化步骤以确保质量，引物设计要求严格，因为不同的miRNA需要专门优化的引物和反应条件。此外，通量有限，成本相对较高，这限制了大规模样本检测的效率，并限制了其在高通量筛查场景中的应用[25]。微阵列技术具有高通量能力，可以同时检测大量miRNA，并提供单个样本中miRNA表达谱的全面概述，有助于识别与疾病相关的miRNA生物标志物组合[26]、[27]。然而，其灵敏度低于qRT-PCR，容易遗漏低丰度的miRNA。此外，芯片生产和检测的高成本限制了其广泛应用[28]、[29]。下一代测序（NGS）技术为miRNA的深度测序开辟了新的途径，能够不受先前知识限制地全面分析样本中所有已知和未知的miRNA序列及其表达水平。研究人员可以从微量尿液样本中创建文库并进行深度测序，发现罕见或新的miRNA并识别序列变异，为精确诊断和治疗提供丰富的目标信息[30]、[31]。然而，昂贵的设备、高昂的测序成本以及对强大计算资源和专业团队的需求构成了显著的技术障碍，使得常规临床应用具有挑战性[32]。与上述技术相比，核酸等温扩增技术具有独特优势。它们可以在恒定温度下操作，简化工作流程，减少反应时间，并降低设备要求。这使得它们非常适合资源有限的现场即时检测，成为低成本、快速临床诊断的最佳选择之一[33]、[34]。聚合酶/核酸酶扩增（PNP）是一种经典的等温核酸扩增方法，利用聚合酶和核酸酶的协同作用实现目标核酸序列的指数级扩增[35]。将PNP与尿液miRNA检测相结合已成为该技术在临床应用中的重要应用。然而，仍存在挑战；传统的PNP方法在识别同源目标miRNA时常常遇到困难，并且检测效率相对较低，需要整合其他技术来提高性能。目前，改进等温扩增技术的研究工作主要沿着两条路径进行。第一条路径涉及合理的探针设计（别构发夹、锁探针和CRISPR-Cas系统），以精确控制反应启动并克服特异性限制。深入理解miRNA生物学，包括它们在物种间的保守调控作用，对于指导探针和扩增系统的智能设计至关重要，这些系统和探针能够区分密切相关的家族成员[36]。第二条路径专注于开发新的信号转导机制（G-四链体增强荧光、表面增强拉曼散射或电化学发光），这些机制与扩增高效结合，以提高灵敏度和加速响应[37]、[38]。尽管在这些不同路径上取得了进展，但临床转化的核心挑战仍然是：如何将这些进展系统地整合到一个简单、稳健的平台上，而不增加操作负担或牺牲反应动力学。
基于此，在本研究中，我们专注于传统的PNP，并引入了发夹结构和辅助探针作为模块化功能区域，构建了一个模块化的聚合酶/核酸酶循环扩增反应（M-PNP）。在传统的形成G-四链体的PNP模板中引入了一个微发夹结构，创建了一个集成的发夹模板LS。这种结构使得miR-21能够识别并展开发夹结构，在聚合酶和核酸酶的作用下，启动扩展反应，促进G-四链体的形成。同时，它取代并回收miRNA，通过目标转化实现信号扩增。此外，辅助探针（IS）被取代并直接用于信号输出。结合生成的丰富G-四链体片段，在与硫黄素T（ThT）结合时能够显著增强荧光信号。发夹结构的引入显著提高了检测系统的特异性，特别是对于同源miRNA显示出稳定可靠的检测效果[39]。此外，发夹结构促进了miRNA的循环，提高了检测的灵敏度和效率。同时，辅助探针的引入提高了系统对目标物质的响应速度和检测效率，使得检测更快、更灵敏[40]。模块化设计具有广泛的适用性，使得这种设计方法适用于各种PNP使用场景，并为疾病诊断提供了更精确可靠的技术手段。这扩展了等温核酸扩增技术在生物医学检测中的应用前景，并支持精准医学的发展。
