背景
在免疫检查点抑制剂（ICI）治疗时代，寻找能够识别最可能获得持久疗效患者的预后生物标志物变得愈发重要。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）因其可通过标准苏木精-伊红（H&E）染色切片进行评估，成为一种广泛可用且成本效益高的生物标志物，受到极大关注。除了实用性，TILs还能提供关于免疫系统与肿瘤细胞之间相互作用的预后信息。尽管TILs的形态学评估在乳腺癌中已标准化，但针对胃食管癌（GEC）的全面评估指南仍然缺乏。本综述旨在总结当前关于TILs在GEC中的组成、临床意义和治疗效用的文献，并基于这些见解提出一个结构化框架，为病理学家进行TIL评估提供实用指导，同时强调GEC病理学特有的挑战。
TILs的组成与临床意义
胃腺癌（GA）和食管腺癌（EA）表现出广泛的基线淋巴细胞浸润，其程度因分子亚型而异。例如，错配修复缺陷肿瘤和爱泼斯坦-巴尔病毒相关GA以免疫浸润水平升高为特征。根据Lauren分类，GA可分为肠型、弥漫型和混合型。肠型表态倾向于表现出中度至高度的基线免疫浸润，而弥漫型通常被认为是免疫“冷”肿瘤，具有最小的细胞毒性T细胞浸润和低PD-L1表达，这与更具侵袭性的肿瘤行为相关。甚至发现免疫浸润程度可能因地理区域而异，非亚洲GA的CD3+、CD4+和CD8+T细胞数量显著高于亚洲GA。在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，已鉴定出免疫抑制（IS）和免疫调节（IM）亚型，两者均以免疫浸润增加为特征。IM亚型富含CD8+T细胞和巨噬细胞，而IS亚型则显示出不同的免疫组成，B细胞和自然杀伤细胞比例更高。ESCC中的地理差异似乎不如GA明显。
发炎的肿瘤微环境（TME），特别是富含CD8+细胞毒性T细胞的环境，已被证明具有预后意义。在接受单独手术治疗的GEC患者切除标本中，高数量的CD8+细胞毒性T细胞通常与良好的生存结果相关。CD8+细胞毒性T细胞是TILs中最普遍的亚群；然而，在各种癌症类型中已鉴定出具有不同功能特征的各种替代性CD8+T细胞亚群，如记忆T细胞和耗竭T细胞。其中一些亚群比其他亚群更有效地促进肿瘤清除，这些亚群的不平衡可能影响预后。尽管如此，在GEC中，对这些CD8+T细胞亚群分化的研究仍处于早期阶段。FOXP3+调节性T细胞在接受单独手术治疗的GEC患者中的作用仍存在争议，高密度既与不良预后相关，也与良好预后相关。多项研究甚至报道，术后高FOXP3+细胞密度与改善的生存指标相关，尽管FOXP3+调节性T细胞主要被描述为免疫抑制性的。这种看似矛盾的现象在结直肠癌患者中也观察到，归因于调节性T细胞的表型和功能异质性。可以鉴定出具有免疫抑制（效应Tregs）和非抑制（初始Tregs）特征的两个不同亚群，这可能解释了不同的临床结果。另一个可能的解释是，FOXP3+细胞的增加可能仅仅反映了T淋巴细胞（CD4+和CD8+）的整体增加。在一些研究中，FOXP3+、CD8+或CD4+T细胞均与患者预后无显著相关。然而，当将这些淋巴细胞亚群组合成比率时（例如，高CD4+/CD8+或CD8+/FOXP3+比率和低FOXP3+/CD4+比率），它们成为独立的有利预后因素。
如今，局部晚期GEC的治疗包括多模式方案，包括新辅助化疗（NACT）或新辅助放化疗（nCRT），这影响了免疫景观的组成。与单独接受手术治疗的患者相比，接受术前治疗的GEC患者切除肿瘤中观察到显著更高数量的CD4+和CD8+T细胞以及减少的FOXP3+T细胞数量。类似地，在比较GEC患者的治疗前活检和治疗后标本时，治疗后样本中观察到CD4+和CD8+T细胞的流入，而调节性FOXP3+T细胞亚群在NACT和nCRT方案过程中趋于减少。这种差异突出了术前治疗重塑TME的能力。有趣的是，在ESCC患者治疗开始前（nCRT和化学免疫治疗方案），升高的CD4+和CD8+细胞水平与延长生存期相关，表明治疗前活检中免疫浸润的组成可能潜在地作为治疗疗效的预测标志物。治疗后高数量的T细胞通常与肿瘤消退的组织病理学证据、放射学反应和良好预后相关。然而，在疗效不佳者中也可以观察到术前治疗后高密度的CD8+T细胞，这可能反映了功能失调的免疫反应，即浸润的细胞毒性T细胞未能有效促进肿瘤清除。治疗后低密度的FOXP3+T细胞与GEC的良好预后相关。
NACT或nCRT诱导的T细胞浸润增加，当与ICI结合时，可以产生协同效应，因为这些疗法在免疫激活的环境中最有效。检查接受ICI方案的GEC患者免疫景观变化的研究有限。然而，据报道，在局部晚期EA和晚期GA患者中，对ICI（无论是单药治疗还是与化疗联合）产生病理学反应的患者中，CD8+T细胞水平较高。在ESCC患者中，组织驻留记忆T细胞（CD103+CD8+）作为潜在的免疫治疗靶点引起了兴趣，因为它们与接受化疗和ICI联合治疗的晚期ESCC患者的延长生存期相关。有令人信服的数据表明，单独化疗可使TME朝向免疫原性细胞死亡的方向演变，从而增强对免疫治疗的易感性。在对ICI有放射学反应的转移性GA患者中，治疗开始后观察到初始、记忆和耗竭CD8+T细胞的扩增，而在缓慢反应者中则未观察到这种情况。这些CD8+T细胞代表了TIL群体的一个子集，强调了需要更好地了解TME如何响应联合治疗策略而演变。
TIL群体还包括B细胞，它们可以占TILs的很大一部分。例如，在乳腺癌中，它们占TIL总数的40%。浸润B细胞和浆细胞在胃食管癌中的预后价值仍不明确，主要与瘤周三级淋巴结构（TLS）结合研究。在接受手术的胃和食管腺癌（GEA）患者中的研究表明，术后升高的CD20+和CD138+细胞水平与延长生存期相关。然而，研究B细胞在新辅助治疗过程中影响的研究仍然有限。来自其他肿瘤类型的见解表明B细胞发挥着重要作用，因为治疗后高水平通常与良好的生存结果相关。尽管如此，由于持续暴露于微生物，浆细胞常见于健康的胃肠道。因此，B细胞和浆细胞在多大程度上促进肿瘤细胞清除，或者它们是否仅仅反映了非特异性的常驻炎症，仍然不确定。
总之，GEC癌症中TILs的组成具有重要的预后价值。一些肿瘤亚型在基线时自然表现出较高水平的免疫浸润。此外，NACT和nCRT将免疫景观重塑为更免疫刺激的环境。这种转变涉及辅助性T细胞（CD4+）和细胞毒性T细胞（CD8+）的增加，同时减少调节性T细胞（FOXP3+）。这些免疫细胞类型的预后关联因治疗方法而异。
形态学TIL评估的治疗效用
前一段概述了TILs的组成及其涉及的各种免疫细胞亚群。在临床实践中，TILs在H&E染色切片上作为单一实体进行形态学评估，不区分特定的免疫细胞类型。在GEC患者H&E切片形态学TIL评估的早期阶段，TIL密度通常使用简化的分类值（例如，无、中度、高）进行报告。也报道了更标准化的方法，这些方法是采用自结直肠癌的指南。例如，Klintrup标准用于评估肿瘤侵袭边缘的炎症浸润。Ropponen分类系统结合TIL数量（0, 1–30, 30–50 和 >50 个细胞/视野）和密度（无、弱、中度和密集）创建四个类别。由于方法学不同，比较这些评分方法具有挑战性。
ITWG关于乳腺癌的建议将TILs定义为半定量测量值，以百分比表示，反映由单核细胞浸润（即淋巴细胞和浆细胞）占据的面积比例。TILs可以在不同的肿瘤区域进行评估：基质TILs在肿瘤基质内评估，而瘤内TILs在肿瘤实质内评分，TILs与癌细胞直接接触。然而，“瘤内TILs”一词在文献中的定义各不相同，有时仅指肿瘤细胞区室，而在其他情况下包括基质和肿瘤细胞区室。瘤内TILs被假设具有生物学意义，因为它们更接近癌细胞。在评估食管癌患者两个区室的研究中，基质TILs通常在多变量分析中保留其预后价值，而瘤内TILs则失去其显著性。这可能归因于这些标本中的瘤内TILs被发现极低且难以评估。
目前局部晚期GEC的标准护理包括nCRT后辅助ICI治疗、围手术期化疗或确定性放化疗。现在随着ICI疗法加入局部疾病治疗，格局正在发生变化。Keynote-585评估了在化疗中加入帕博利珠单抗，显示与单独化疗的患者相比，无事件生存期（EFS）有数值上的改善，但未达到总生存期（OS）的主要终点。虽然较高的PD-L1 CPS评分与改善的病理完全反应相关，但并未转化为生存获益。MATTERHORN试验证明了在围手术期化疗中加入度伐利尤单抗具有显著的EFS获益，但未观察到显著的OS获益。值得注意的是，该研究使用PD-L1 TAP评分而非CPS进行患者分层。PD-L1 CPS、TPS和TAP评分目前驱动着临床决策。然而，鉴于其不一致性，越来越需要更可靠的生物标志物来预测免疫治疗反应。TILs已成为一种有前景且易于获得的替代方案。
在GEC患者的切除标本中，无论是单独手术治疗还是NACT治疗后，高基质TILs在多项研究中一致与延长生存期相关。基线TIL密度高的患者更可能经历对nCRT的放射学反应和延长生存期，强调了TILs的预测价值。在ICI治疗前收集的食管癌标本中也观察到类似趋势，突出了它们在筛选可能对免疫治疗有反应的患者中的潜在作用。由于样本量有限，关于TILs作为免疫治疗反应预测生物标志物的附加价值的明确结论有限。未来，因此建议进行回顾性分析，以研究TILs的附加价值，并比较TILs是否优于PD-L1 CPS、TPS或TAP评分。其次，如果TILs被证明可以预测免疫治疗反应，这将能够识别GEC中的真实反应者，并支持为低TIL肿瘤患者探索新的药物机会。
问题仍然存在：在GEC患者中，什么定义了临床相关的TIL-high评分？报告的临界值差异很大，从10%到50%不等，取决于所研究的患者群体。例如，在EBV相关胃癌中观察到相对较高的TIL水平。然而，在涉及ESCC患者的研究中，50%的临界值并不常见，因为只有少数患者表现出如此高的TIL百分比。文章中提到的临界值来源于特定的患者群体，不能可靠地外推到更广泛的真实世界环境，因为没有一项在外部数据集上得到验证。在回顾性研究中，研究TILs在GEC中预测价值的新阈值是可行的。鉴于这项研究尚不成熟，建议最初将TIL密度作为连续变量进行评估。这种方法允许识别潜在的临界值，这些临界值可以指导未来前瞻性试验中的二分策略，最终支持TILs作为临床相关生物标志物的验证。
总之，基质TILs是GEC标本形态学评估的首选，因为它们一致证明预后价值，并作为生存结果的可靠生物标志物。尽管PD-L1评分目前用于（免疫）反应分层，但评分系统和临界阈值的变化限制了其稳健性。TILs代表了一种有前景的替代方案，应在未来研究中与现有的CPS、TPS和TAP进行比较。在乳腺癌中，工作组的当前建议是评估TILs以及PD-L1。类似的发展可能在GEC以及其他肿瘤类型中设想。为了建立高TIL密度的临床相关阈值，必须将TILs作为连续变量进行评估，保留预后细节，避免在缺乏验证临界值的情况下任意二分。
GEC中评估TILs的方法学建议
TIL评分的标准化是确立该生物标志物预测价值、免疫治疗反应的临床相关临界值以及潜在日常临床应用的重要一步。在不同肿瘤类型中使用可比方法和一致步骤进行TIL评估也至关重要。基于当前文献，我们为GEC中TILs的评估开发了一个结构化框架。重要的是，这份GEC指南与ITWG关于其他肿瘤类型TIL评估的建议一致。该框架旨在通过提供TIL评分的标准化方法来促进TIL评估，而不是规定GEC患者的治疗决策。目前，没有足够的证据来确定高或低TILs的临界值。临界值可能因肿瘤亚型以及评估是在治疗前还是治疗后而异。因此，进一步的研究，包括内部和外部验证，对于建立准确可靠的阈值至关重要。因此，本指南应经过深思熟虑后应用，考虑实施的具体临床或研究背景。该框架遵循四个步骤：（i）定义肿瘤区域，（ii）定义基质区域，（iii）确定免疫浸润类型和（iv）确定TILs百分比。开发了一个遵循上述步骤的简明教程，以及一个摘要表，可以在ITWG网站上找到。
定义肿瘤区域
TILs应严格在浸润性肿瘤边界内进行评估。位于肿瘤边界外的免疫细胞，包括三级淋巴结构（TLS）内的、不典型增生区域、正常腺体或非恶性黏膜中的免疫细胞，应被排除。同样，大面积坏死、浅表糜烂、溃疡、挤压伪影和松散碎片不应被考虑。
定义基质区域
基质TILs已证明预后价值，并且在研究中比瘤内TILs更常用，这可能与GEC中评估瘤内TILs的挑战有关。为了提高可重复性，我们因此建议仅关注肿瘤实质的基质区室。定义肿瘤相关基质有时可能具有挑战性，特别是在粘附性差的腺癌和基质含量低的肿瘤中。当肿瘤和基质无法可靠区分时，TILs应报告为单一总分，不区分区室。区分肌肉和基质组织使评分复杂化，因为病理学家不仅需要过滤掉肿瘤区域，还需要视觉区分并排除肌肉组织，这给整个过程增加了额外步骤。我们建议排除黏膜肌层和固有肌层的厚肌纤维，而可以与胶原纤维混合的薄孤立肌纤维可以包括在内。此外，不应评估细胞外黏液、恶性腺体的腔内空间和瘤内血管。
确定免疫浸润类型
所有单核细胞，包括淋巴细胞和浆细胞，都应被评分。浆细胞单独的预后价值在GEC中尚未确立。然而，基于形态学区分浆细胞与其他免疫细胞具有挑战性，将其从评分中排除不切实际。类似的方法用于ITWG关于乳腺癌TILs评估的建议中，其中浆细胞被包括在TIL评分中以保持一致性和简单性。遵循此先例，我们建议将浆细胞纳入GEC的评分过程。粒细胞和其他多形核细胞，尽管在GEC组织中丰富，不应包括在最终TIL评分中。
确定基质TILs百分比
在确定基质TILs百分比时，重要的是避免只关注热点。这在异质性肿瘤中尤其相关，例如GEA，其空间异质性（例如HER2表达）比乳腺癌更明显。因此，平均多个感兴趣区域可以提供更具代表性的评分。为了进一步支持GEC中的TIL评估，为六个定义的组（<1%, 1%–5%, 6%–10%, 11%–20%, 21%–50% 和 >50%）创建了参考图像。这些图像作为视觉指南以增强评分一致性。在评估中间类别（11%–50%）时，使用较低的放大倍数可能会有帮助。病理学家应将其评分报告为连续变量，提供他们认为合适的尽可能多的细节。使用半定量评分系统可能减少病理学家间的变异性，因为人类在明确定义的组内工作时更容易达成一致。然而，为了进行稳健的统计分析和可靠的跨研究比较，连续变量是首选。
潜在陷阱
虽然尚未确定所有潜在陷阱的范围，但已知一些特定问题在评估TILs时会引起问题。在某些复杂病例中，多种组织病理学特征重叠，例如粒细胞大量存在、肌纤维和有限的基质区域。细胞密度高的区域可能特别难以评估，特别是当大部分免疫浸润由中性粒细胞组成时。此外，在某些区域区分基质和肿瘤组织可能很困难，TIL百分比应在整个区域进行评估，而不区分两个区室。小的肿瘤细胞也可能类似于TILs，使准确评分复杂化，并可能导致高估。在肿瘤细胞和TILs形态相似的情况下，缩小视野以评估整体模式可能有助于区分。
未来展望
本研究中概述的框架为GEC中TILs的标准化评估和报告奠定了基础。作为该框架的一部分，可以开发和实施包含集成视觉参考反馈的决策支持工具，以增强TIL评分的一致性并减少病理学家间的观察者变异性。建立TILs作为稳健预测性生物标志物的初始步骤之一是实施广泛的TIL评分，并在回顾性研究中评估其治疗效用，将TIL评分与临床结果相关联。从回顾性研究转向前瞻性研究对于确立TILs作为治疗反应预测性生物标志物的有用性以及定义可靠的临床相关TIL临界值至关重要。
改进当前免疫治疗反应的预测性生物标志物仍然至关重要，因为各种PD-L1评分系统（CPS、TPS和TAP）继续引起临床模糊性。随着免疫治疗整合到局部疾病治疗的新兴适应症，定义反应者以证明免疫治疗的附加价值非常重要。同样重要的是早期识别无反应者，以便采取替代治疗策略。在此背景下，我们旨在未来验证TILs作为一种新的预测性生物标志物。
此外，深度学习方法在GEC的TIL评估中具有巨大前景，因为整个切片图像的庞大规模使得视觉评分对病理学家具有挑战性。这些方法允许对TIL密度（细胞/mm²）进行定量结果测量。它们还能够分析空间特征，包括聚类模式以及TILs与肿瘤细胞的接近程度。尽管如此，当前的GEC研究通常评估整个组织切片中的TILs，而不区分肿瘤相关基质和上皮内区室。未来的研究应解决这一局限性，并探索识别特定TIL亚群（如浆细胞）的可行性，以评估其个体预后价值。
