César Pedroza-Roldán、Mauricio Realpe-Quintero、Claudia Lisette Charles-Niño、Jeannette Barba-León、Jorge Gaona-Bernal
墨西哥哈利斯科州萨波潘市，瓜达拉哈拉大学，生物科学与农业科学中心兽医医学系，Ramón Padilla Sánchez街2100号，邮编44600
摘要
犬细小病毒2型（CPV-2）感染仍然是犬类发病和死亡的主要原因，尤其是在未接种疫苗的幼犬中。尽管其具有临床意义，但驱动疾病进展的免疫机制仍知之甚少。在这项研究中，我们分析了41只自然感染CPV-2c的犬只的血液学参数、病毒分子分型以及血浆细胞因子谱，并与15只健康对照组进行了比较。淋巴细胞减少以及IL-6、MCP-1、IL-8和KC样细胞因子水平的升高与死亡率显著相关。相反，较低的IFN-γ水平与康复相关。死亡的犬只中，IL-6与KC样细胞因子、IL-6与MCP-1以及IL-8与MCP-1之间存在强相关性。所有感染的犬只都携带CPV-2c变异株，这一点通过RFLP和测序得到了证实。虽然这些结果基于入院时的单次测量数据，但它们表明，细胞因子谱分析（特别是IL-6、MCP-1和IFN-γ）以及淋巴细胞计数可能作为评估CPV-2c感染犬只疾病严重程度和预后的有用生物标志物。
引言
犬细小病毒（CPV-2）是导致犬胃肠炎的最常见病毒性病原体之一。这种无包膜病毒由大约5.2 kb的单链正链基因组组成。该基因组编码两种蛋白质前体：a) 非结构蛋白前体NS1/NS2和b) 结构蛋白前体VP1/VP2（Reed等人，1988年）。非结构蛋白NS1具有多种功能，包括调节病毒基因表达，并与感染细胞中的细胞凋亡有关（Cotmore和Tattersall，2007年）。另一方面，结构蛋白VP2负责病毒的细胞趋向性，并包含最重要的抗原位点，这些位点是中和抗体的靶标（Callaway等人，2018年）。该病毒在全球范围内分布，其主要抗原变异株CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c主要通过VP2蛋白关键位置的氨基酸替换来区分，例如残基426（CPV-2a为Asn，CPV-2b为Asp，CPV-2c为Glu），尽管其他VP2位点也存在变异（Miranda和Thompson，2016年）。初次感染后，病毒在肠系膜和口咽淋巴结中复制，犬只会在暴露后1至5天内出现病毒血症。4至14天后，病毒会感染分裂速度快的细胞，如肠上皮细胞等。随后犬只开始排出病毒颗粒，并出现呕吐、腹痛和出血等临床症状，这些症状可能持续数天（Basak和Turner，1992年）。在血液学检查中，可发现由于中性粒细胞（中性粒细胞减少）和/或淋巴细胞（淋巴细胞减少）丢失导致的白细胞减少。此外，还可能出现贫血、单核细胞增多、血小板减少和全血细胞减少（Carman和Povey，1985年）。高水平的病毒复制和NS1蛋白的毒性可能导致肠上皮细胞严重受损，从而引起营养吸收不良、血便和细菌移位（Gupta等人，2016年）。此时，犬只处于高风险状态，因为细菌移位可能导致全身炎症反应综合征（SIRS）、多器官衰竭、弥散性凝血障碍，最终导致死亡（Iris等人，2010年）。细胞因子是一类可溶性蛋白质，在对病原体的免疫反应中起关键作用，调节免疫细胞的功能和相互作用，并充当生长因子。这些分子主要由免疫系统细胞分泌，包括白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、I型和II型干扰素（IFN）、集落刺激因子（CSF）和趋化因子。根据其功能，细胞因子可分为促炎型、抗炎型、趋化型以及调节免疫系统细胞生长和分化的类型。尽管CPV-2的临床意义显著，但其疾病进展的免疫机制仍不明确。例如，Otto等人（1997年）报告在CPV-2感染犬只的血浆中检测到脂多糖（LPS）和TNF-α，提示存在全身性炎症。然而，自然感染CPV-2c期间的全面细胞因子谱分析尚未完成（Otto等人，1997年）。相反，研究发现，在CPV-2感染期间，由于严重的中性粒细胞减少，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）水平升高。同样，在CPV-2感染恢复期，随着G-CSF水平恢复到基线水平，中性粒细胞的产生也会增加（Cohn等人，1999年）。单核细胞趋化因子1（MCP-1）是一种促进单核细胞从骨髓迁移到炎症部位的细胞因子，在CPV-2感染的犬只中其水平显著升高（Duffy等人，2010年）。总体而言，这些发现表明CPV-2感染会破坏与细胞激活、运动性和造血相关的某些细胞因子的平衡。我们假设细胞因子失调和淋巴细胞减少与CPV-2c感染犬只的不良临床结果有关。然而，需要更全面地了解自然感染CPV-2的犬只中细胞因子和趋化因子水平的变化。本研究旨在表征自然感染CPV-2c的犬只的细胞因子谱和血液学变化，并将其与临床结果相关联。
研究描述
本研究在瓜达拉哈拉大学的小型动物兽医医院进行，该医院为瓜达拉哈拉大都会区的伴侣动物提供医疗服务。纳入研究的犬只表现出胃肠症状，如呕吐、腹泻和腹痛。这些犬只接受了全面的身体检查，并通过直肠拭子采集粪便样本进行侧向流动检测以检测CPV-2相关病毒。
研究中的犬只特征
从临床记录中提取了有关动物年龄、疫苗接种情况、驱虫史和品种的数据。然后对这些动物进行监测并记录其康复或死亡情况（补充表1）。在41只CPV-2阳性的犬只中，60.9%（n=25）康复，39%（n=16）死亡。在年龄方面，65.8%（n=27）的犬只年龄在1至3个月之间，其中59.2%（n=16）康复，40.7%（n=11）死亡。
讨论
死亡犬只（38.4%）中的白细胞减少现象略高于康复犬只（33.3%）。然而，大多数未存活的犬只（61.5%）的总白细胞计数仍在参考范围内，表明这一参数本身并不能可靠地预测预后。同样，76.9%的未存活犬只的中性粒细胞计数在参考范围内，只有23%表现出中性粒细胞减少。González-Domínguez等人也报告了类似的结果。
研究的局限性
研究中存在一些局限性，例如，感染犬只（1-3个月大）与健康对照犬只（6-24个月大）之间存在年龄差异。尽管努力纳入了具有代表性的对照组，但这些年龄差异可能会影响基线免疫参数，未来的研究可以针对非常年幼的犬只设置更精确的年龄匹配对照组。死亡犬只组（n=16）的样本量相对较小，这可能会影响研究的准确性。
伦理批准
该研究获得了瓜达拉哈拉大学兽医医院的生物安全、研究和伦理委员会的批准。宠物主人被告知研究的目的和程序，并同意从犬只身上采集直肠拭子样本。研究遵循了联邦法规NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002、NOM-033-ZOO-1995和NOM-062-ZOO-1999。
利益冲突
作者声明与本研究、文章的作者身份和发表无关的潜在利益冲突。
资助
本研究部分得到了瓜达拉哈拉大学SNI和SNCA生产改进支持计划的支持。
CRediT作者贡献声明
Jorge Gaona-Bernal：撰写、审稿与编辑、数据分析。
Jeannette Barba-León：撰写、审稿与编辑、数据分析。
Mauricio Realpe-Quintero：撰写、审稿与编辑、方法学设计、研究实施、数据分析。
Claudia Charles-Niño：撰写、审稿与编辑、研究实施、数据分析。
César Pedroza-Roldán：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、资金申请、数据分析、概念构思。
利益冲突声明
作者声明与本研究、文章的作者身份和发表无关的潜在利益冲突。
