细菌胞外囊泡（BEVs）是细菌分泌的具有脂质双分子层结构的纳米级囊泡。它们携带来自亲本细菌的多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和代谢物，使其成为对抗细菌感染的理想候选者。随着抗生素滥用导致耐药性问题日益严峻，开发新型抗菌策略迫在眉睫。BEVs凭借其独特的生物学特性，正作为一种创新的“纳米武器”受到广泛关注。
BEVs的生物发生与生物组分
根据染色特性，细菌可分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌具有内膜（IM）、薄的肽聚糖（PG）层和展示脂多糖（LPS）的外膜；而革兰氏阳性菌仅有内膜和厚的展示脂磷壁酸（LTA）的肽聚糖层。尽管结构不同，两者均能自发分泌BEVs。
革兰氏阴性菌主要通过两种途径产生BEVs：一是外膜出芽，产生经典的外膜囊泡（OMVs）；二是爆炸性细胞裂解，产生爆炸性外膜囊泡（EOMVs）和外内膜囊泡（OIMVs）。OMVs仅包含外膜成分，而EOMVs和OIMVs因肽聚糖层受损，还含有细胞质成分。革兰氏阳性菌则主要通过肽聚糖层降解引发的气泡样细胞死亡产生细胞质膜囊泡（CMVs），其成分包括质膜蛋白、核酸和内溶素，不含LPS但含有LTA。这些不同的生物发生机制导致BEVs具有 distinct 的组成，进而影响其生物学功能。
BEVs的分离与工程化策略
从复杂发酵液中高质量地分离BEVs是其应用的基础。常用技术包括超速离心（UC）、密度梯度离心（DGC）、超滤（UF）、尺寸排阻色谱（SEC）、蛋白质沉淀和亲和分离等。这些方法各有优劣，例如UC操作简单但纯度较低，DGC纯度高但耗时费钱。组合使用多种技术（如UC、UF和DGC联用）可有效提高BEVs的得率和纯度。
为了充分发挥BEVs的治疗潜力，研究者们开发了多种工程化策略，主要分为对亲本菌株的工程化（遗传工程）和对分离后BEVs的工程化（物理和化学工程）。
对亲本菌株的工程化主要通过重组质粒或CRISPR-Cas9技术实现基因过表达或敲除。例如，通过敲除脂质A生物合成相关基因（如lpxM, lpxL）或毒力因子编码基因（如金黄色葡萄球菌的agr和sea），可以降低BEVs的免疫原性或致病性。同时，通过改造与膜流动性和肽聚糖交联相关的基因，可以提高BEVs的产量。此外，还可以将功能蛋白或多肽（如抗菌肽LL-37）与锚定基序融合，使其表达在细菌表面或内部，从而被BEVs继承。
对分离后BEVs的工程化则更为灵活。物理工程方法包括膜融合和膜包被。膜融合可将不同来源的BEVs或BEVs与脂质体融合，获得均一且功能增强的杂化囊泡。膜包被是将BEVs包被在抗菌纳米颗粒（如金、银纳米颗粒）或载药纳米颗粒表面，利用BEVs的同源靶向性提高递送效率。化学工程方法包括共价结合（如生物偶联、醛胺缩合、点击化学）和非共价结合（如疏水插入、静电相互作用、受体-配体结合）。这些方法可用于在BEVs表面修饰靶向肽、穿膜肽或抗原展示肽，赋予其新的功能。
天然BEVs用于细菌感染治疗
天然BEVs因其携带的活性物质可直接用于抗菌治疗。一方面，BEVs可作为抗菌剂。许多细菌为在生存竞争中占据优势，会分泌含有抗菌物质的BEVs，如自溶素、水解酶和热稳定小分子（如鼠李糖脂、HMNQ）。这些BEVs能够裂解竞争细菌、抑制或清除生物膜，甚至进入宿主细胞杀死胞内病原菌（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA）。此外，BEVs还能将噬菌体附着分子等抗原传递给耐药菌，使其变得敏感，从而实现“耐药-敏感”转化。
另一方面，BEVs可作为抗粘附剂。细菌粘附是感染的第一步。BEVs继承了亲本菌的表面粘附素，可作为“诱饵”竞争性地结合宿主细胞表面的粘附素受体，从而阻断病原菌的粘附与定植。例如，幽门螺杆菌（H. pylori）和乳酸菌来源的BEVs均被证明能有效抑制相应病原菌的粘附。
工程化BEVs用于细菌感染治疗
通过工程化手段，可以进一步提升BEVs的治疗性能，拓展其应用角色。
BEVs作为疫苗抗原
BEVs表面展示的病原相关分子模式（PAMPs）和病原特异性抗原使其成为天然疫苗候选者。然而，天然BEV疫苗可能存在LPS相关毒性高、抗原谱覆盖有限、尺寸不均一等局限。通过工程化手段可优化其性能：例如，使用去垢剂或基因工程（如改造脂质A）去除或减毒LPS，降低免疫原性同时保留足够的免疫刺激能力；通过基因工程（如增加fHbp基因拷贝）提高特定抗原的表达水平，或展示多价抗原（如PorA亚型），以增强免疫效果；通过包载纳米颗粒（如金纳米颗粒、聚酐纳米颗粒）或采用氮空化等技术控制BEVs的尺寸，使其更利于被抗原呈递细胞（APCs）摄取，从而提升免疫效力。
BEVs作为疫苗佐剂
BEVs富含PAMPs，能有效激活先天免疫，促进APCs成熟和抗原呈递，其纳米尺寸也利于淋巴引流和APCs吞噬，因此是优秀的疫苗佐剂。BEVs与蛋白或多糖抗原的结合方式多样：可简单混合；可通过化学偶联（如利用SpyCatcher/SpyTag系统）或物理插入（如GPI锚定）将抗原外源锚定在BEVs表面；也可通过基因工程（如利用自体转运蛋白Hbp、细胞溶素ClyA或外膜蛋白OmpA等平台）将抗原内源表达在BEVs表面或腔内。这些工程化BEV佐剂能显著增强针对细菌（如结核分枝杆菌、鲍曼不动杆菌）甚至病毒（如SARS-CoV-2）抗原的特异性抗体反应和T细胞免疫。
BEVs作为递送纳米载体
BEVs具有类似脂质体的脂质双分子层结构，可作为抗生素的纳米载体，提高药物稳定性、靶向性和利用率。早期研究利用细菌对抗生素的外排机制，通过将细菌在含抗生素培养基中培养，被动地将抗生素（如庆大霉素）载入BEVs。此外，物理方法（如超声、电穿孔、膜融合）和化学方法也可用于主动载药。为提高靶向性，可利用BEVs对同源细菌的天然趋向性，或通过基因工程在BEVs表面表达特异性靶向配体（如抗Bap蛋白）。还可以将BEVs与其他囊泡（如中性粒细胞膜囊泡）融合，构建能靶向炎症微环境的杂化递送系统，实现抗生素的精准递送。
前景与展望
BEVs在抗菌治疗领域展现出巨大潜力，其优势在于固有的生物功能、可扩展的生产以及可定制的工程化。商业化BEV疫苗Bexsero的成功为其他BEV疗法的临床转化提供了范例。然而，BEVs的成分复杂性、制备标准化和长期生物安全性仍是需要面对的挑战。未来，结合人工智能（AI）指导的多组学分析、材料工程和多功能化策略，有望设计出更安全、高效的BEV基治疗制剂。针对不同感染部位（如肺部、伤口）开发相应的给药途径（如吸入剂、微针）也将是重要方向。通过跨学科合作，BEVs有望成为对抗细菌感染，特别是耐药菌感染的强大纳米武器。
