引言
N-糖基化是一种关键的翻译后修饰，其中以唾液酸结尾的N-糖链对糖蛋白的生物功能尤为重要。在多种N-糖链骨架中，双臂结构是最典型的形式。其非还原末端连接的唾液酸——与半乳糖或N-乙酰半乳糖胺相连——调控着包括细胞间识别、免疫调节、神经发育以及糖蛋白折叠和代谢命运等关键生物过程[1]、[2]、[3]。典型的双臂复合型N-糖链具有核心五糖结构Man3GlcNAc2（记为A2M3）。这种结构通常会扩展形成A2G2S2基序（其中A = N-乙酰葡萄糖胺，M = 甘露糖，S = 唾液酸），并通过天冬酰胺残基共价连接到多肽主链上[4]、[5]、[6]。末端糖基化模式直接调节糖蛋白在体内的稳定性和功能活性。一个显著的例子是肝细胞非唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），它特异性识别并内化带有末端半乳糖残基的糖蛋白，将其靶向循环清除。用唾液酸修饰天线端可以有效地掩盖这一识别信号，从而延长血清半衰期[7]、[8]。类似的调节机制也存在于免疫球蛋白G中，Fc部分的唾液酸化程度影响抗炎活性和适应性免疫的平衡[9]、[10]、[11]。此外，唾液酸修饰对乳铁蛋白的抗菌活性也是必需的。这些唾液酸化的N-糖链直接促进微生物表面结合，导致细胞裂解；相反，去糖基化的乳铁蛋白则失去了这一功能[12]。重组人红细胞生成素（rhEPO）提供了另一个有力的例证：去唾液酸化的rhEPO在体外仍具有生物活性，但在体内完全失去功能，这突显了末端唾液酸在生物识别和循环稳定性中的关键作用。有趣的是，通过半乳糖氧化酶介导的氧化可以部分恢复体内的效力[13]。综上所述，N-糖链非还原末端存在唾液酸和半乳糖对于糖蛋白在生物系统中的完全表达是不可或缺的。
尽管唾液酸化N-糖链具有重要的功能意义，但其大规模生产仍受到高成本和低产量的限制。目前，大多数治疗性糖蛋白是在动物细胞系统（如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞）中生产的，这些细胞能够生成具有类似人类N-糖链的糖蛋白[14]。然而，动物细胞培养系统本质上成本效益低且难以扩大到工业规模[15]。为了解决这些限制，已经开发了多种体外唾液酸化策略。例如，Kajihara及其同事从蛋黄中分离出唾液酸糖肽（SGP），并通过固相合成将其特异性连接到红细胞生成素（EPO）上，证明了SGP单元的数量和分支模式对体内活性的积极影响[16]。在另一项研究中，Tanaka等人将SGP接枝到琥珀酰亚胺聚合物骨架上，显著增强了其对凝集素和流感病毒血凝素的亲和力[17]。此外，使用重组唾液酸转移酶和CMP-Neu5Ac进行酶促唾液酸化已成功用于体外修饰重组α-1-抗胰蛋白酶及相关糖蛋白[18]、[19]。另外，一些研究小组利用富含唾液酸的fetuin作为唾液酸供体，与乳糖或其衍生物作为受体，通过转唾液酸酶催化酶促合成唾液酸乳糖或唾液酸化寡糖——这一策略避免了使用昂贵的CMP-Neu5Ac[20]、[21]。Noble等人也使用转唾液酸酶生成了唾液酸化糖脂[22]。然而，关于转唾液酸酶催化的糖蛋白唾液酸化的报道尚未见。尽管取得了这些进展，化学和酶法仍然受到天然糖链前体和糖核苷酸供体高成本的限制。此外，化学方法通常需要后续的蛋白质重折叠以恢复生物活性。因此，开发一种简单且经济高效的方法来合成结构明确的双臂双唾液酸化寡糖为体外蛋白质唾液酸化提供了一种新的策略。
乳铁蛋白是一种高度糖基化的糖蛋白。人乳铁蛋白含有三个潜在的N-糖基化位点（Asn138、Asn479和Asn624），而山羊、牛和绵羊乳铁蛋白各自具有五个位点（Asn233、Asn281、Asn368、Asn476和Asn545）。小鼠乳铁蛋白仅在Asn476处有一个这样的位点[23]。值得注意的是，不同哺乳阶段的牛乳铁蛋白——初乳、过渡乳和成熟乳——在N-糖链结构和组成上存在显著差异，尤其是在末端唾液酸含量方面。Jia等人通过质谱分析报告称，双臂唾液酸化N-糖链在过渡乳中的相对丰度为14.5%，在初乳中降至1.3%，在成熟乳中降至0.9%[24]。3′-唾液酸乳糖（3′-SL）是一种重要的人乳寡糖（HMO），在婴儿免疫系统发育中起重要作用，并在婴儿配方奶粉中具有巨大的商业潜力。然而，动物乳中仅含有微量的3′-SL，因此直接提取不切实际。最近，微生物生产在安全性、成本和可扩展性方面具有明显优势，已成为3′-SL的主要生产方法，其市场价格约为200美元/千克[25]。
材料
半胱胺盐酸盐、N2,N6-双(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸和乳铁蛋白购自Yuanye Bio-Technology（中国上海）。(氯(4-甲氧基苯基)亚甲基)二苯购自上海Titan Technology（中国上海）。马来酰亚胺-PEG1000-甲醛由Xinyan Biotech（中国西安）提供。3′-唾液酸乳糖（纯度98%）由Chr. Hansen（丹麦）赠送。所有其他化学品均购自Sinopharm Chemical Reagent（中国上海）。
方法
反应
讨论
本研究提出了一种生物模拟新糖链的设计，使用PEG1000作为连接剂，作为天然N-糖链核心（A2M3）的功能性模拟物，而非结构模拟物。结合过程通过赖氨酸残基完成，无需预先去除蛋白质的天然N-糖链。这种方法不同于效率低下的多步骤天然寡糖合成方法，并利用PEG的亲水性来提高蛋白质的溶解性和稳定性。从经济角度来看，这种方法具有显著优势
结论
我们报道了一种结构明确的双臂唾液酸化寡糖模拟物（化合物10）的设计和合成，该方法实现了体外蛋白质唾液酸化的稳健和实用方法。收敛合成过程从半胱胺盐酸盐、N2,N6-双(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸和唾液酸乳糖开始，通过还原胺化后进行硫醇-马来酰亚胺Michael加成，在生物相容的PEG骨架上引入类似天然的Neu5Ac和Gal基序。
作者贡献声明
顾一群：研究、数据管理。
王迪：撰写——初稿、验证、项目管理、方法学、研究、数据管理。
高敏杰：验证、资源准备。
吴建荣：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思
