4-氯-N′-(2-氰基乙酰)苯肼衍生物的合成、细胞毒性研究、VEGFR-2/EGFRT790M生物活性测定以及计算机模拟对接（in silico docking）和药物代谢动力学（ADMET）分析

抗癌药物设计及活性研究：合成了11种含氮杂环衍生物，评估其对A549、MCF-7、HCT-116和HepG2癌细胞系的细胞毒性，发现化合物4、5、6、7、8、10、11对四类癌细胞IC50值介于5.50-9.65 μM，较索拉非尼和厄洛替尼更具活性。同时，通过分子对接验证化合物3、4、5、6、7、8、10对EGFR T790M和VEGFR-2的抑制活性，其中化合物10、7、6对EGFR T790M抑制IC50分别为0.30、0.35、0.40 μM，化合物7、6、5、10对VEGFR-2抑制IC50低于2 μM。

作者名单：Seham Sabry Abd Elmeneim Deghaidi、Esraa Nazieh El-Bery、Sabreen Mohamed El-Gamasy、Nashwa M. Saleh、Nour E.A. Abd El-Sattar、Tamer Nasr、Ahmed El-Morsy、Khaled El-Adl、Mo’men Salem

所属机构：埃及萨达特市Alryada科学技术大学牙科学院基础与医学科学系，邮编32897

摘要

本文评估了2-11号化合物对人类肺癌（A549细胞）、乳腺癌（MCF-7细胞）、结直肠癌（HCT-116细胞）和肝细胞癌（HepG2细胞）的细胞毒性。同时，这些化合物还通过酶活性检测被验证为双重突变的表皮生长因子受体（EGFR^T790M）和血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）的抑制剂。与索拉非尼（4.04 μM）和厄洛替尼（5.49 μM）相比，化合物4、5、6、7、8、10和11的IC₅₀值在5.50–8.00 μM范围内，显示出极高的细胞毒性。在MCF-7细胞实验中，化合物5、6和7的IC₅₀值分别为7.55、6.95和5.60 μM，也表现出很强的细胞毒性。对于HCT-116细胞，化合物7的IC₅₀值为9.50 μM，其细胞毒性同样显著。化合物5、6、7、8和10对HepG2细胞的IC₅₀值在8.00–9.65 μM范围内，表明它们具有极高的细胞毒性（相比之下，索拉非尼和厄洛替尼的IC₅₀值分别为4.00 μM和7.73 μM）。此外，化合物3、4、5、6、7、8和10对VERO细胞的毒性较低，IC₅₀值在48.80–52.50 μM之间。化合物7、6、5和10在VEGFR-2抑制剂方面的活性较强，IC₅₀值分别为0.96、1.10、1.35和1.90 μM；化合物10、7和6对EGFR^T790M的抑制作用也显著，IC₅₀值分别为0.30、0.35和0.40 μM。通过分子对接实验进一步验证了这些化合物与VEGFR-2和EGFR^T790M受体的结合亲和力和定位。

引言

癌症是一种以细胞无控制生长和增殖为特征的疾病，通常由正常的细胞周期调控机制紊乱引起[1]。治疗方法包括化疗、放疗、免疫疗法、激素疗法和靶向治疗等。选择何种治疗方法取决于癌症类型、分期、位置、遗传特征以及患者的整体健康状况。如果肿瘤局限且可手术，手术仍然是最古老且最有效的治疗方法之一[2]。化疗是消除肿瘤的有效手段。开发具有多种作用机制、优异疗效、良好药代动力学特性和低副作用的新抗癌药物对于完善现有治疗方案至关重要[3]。VEGFR-2和EGFR作为酪氨酸激酶，与多种疾病类型和不同类型的癌症生长有关[4]。两者之间存在密切关联，并共享共同的信号通路[5]。VEGFR-2的激活不依赖于EGFR的信号传导，而VEGFR-2信号通路的抑制剂可以增强EGFR抑制剂的抗癌效果。因此，同步阻断EGFR和VEGFR-2的信号通路被认为是癌症治疗中的重要策略[6]、[7]、[8]。最新的癌症药物研发进展表明，含氮杂环化合物在多种癌症治疗中具有潜力，尤其是那些能够抑制EGFR和VEGFR-2的化合物，因为这两种受体与肿瘤微环境密切相关[9]。许多含氮杂环结构（如吡啶类[例如帕唑帕尼]、吲哚类[例如尼达尼布]、吡啶类[例如索拉非尼]、吡唑类[例如厄洛替尼]和吡咯类[例如舒尼替尼]已被证实可用于设计新的酪氨酸激酶抑制剂[9]。 大多数VEGFR-2抑制剂具有以下共同特征[10]、[11]、[12]：含有胺基或脲基的药效团，这些基团与Asp1046和Glu885等碱性氨基酸相连；疏水性末端基团能够占据酶的疏水裂隙并形成疏水键；平面杂环芳香环结构；以及中心疏水连接基团。EGFR抑制剂还具备以下结构要求：i) 能够与连接域中的氨基酸形成氢键的氢键受体或供体（例如NH基团）；ii) 能够抑制腺嘌呤口袋的杂环芳香结构；iii) 亲脂性头部，能够与疏水区域相互作用；iv) 由疏水尾部抑制的疏水区域[13]、[14]（见图2）。 根据VEGFR-2和EGFR抑制剂的基本药理结构，研究人员设计了新的4-氯-N′-(2-氰乙酰)苯肼化合物。设计策略包括使用4-氯苯基作为疏水基团，通过CONHNHCO连接基团进行连接，并采用可自由旋转的脂肪族链（如化合物2-9）或吡啶环（如化合物10和11）。图1和2中展示了索拉非尼、帕唑帕尼（VEGFR-2抑制剂）和厄洛替尼（EGFR抑制剂）作为含氮抗癌药物的例子。 在本研究中，作者合成了含有氮原子的延长型、可自由旋转的化合物（而非环状结构，如化合物2-9），并比较了这些化合物与环状吡啶类化合物（如化合物10和11）对HCT-116、MCF-7、A549和HepG2细胞的细胞毒性。同时，对所有化合物进行了分子对接实验，以预测它们与VEGFR-2和EGFR受体的结合位点及其结合方式。

化学方法

所需化合物的合成方法见图1、图2、图3和图4。4-氯-N′-(2-氰乙酰)苯肼（1）的合成方法是将等摩尔量的4-氯苯甲酰氯与2-氰乙酰肼在二甲基亚酰胺（DMF）中搅拌反应，使用催化剂（同时吸收生成的HCl）[19]（见图1）。Knӧvenagel缩合反应[20]、[21]生成了新的芳基亚甲基衍生物。

结论

通过Knӧvenagel缩合反应，研究人员设计并合成了新的芳基亚甲基衍生物2-9。传统的3-(2-溴苯基)-2-氰丙烯酰)-4-氯苯肼（2）与马来酰腈和/或乙基氰乙酸酯反应，分别生成了吡啶-2-酮衍生物10和11，且产率高于一步法合成。本研究合成了含有氮原子的延长型、可自由旋转的化合物（而非环状结构），并与环状化合物进行了比较。

4-氯-N′-(2-氰乙酰)苯肼（1）的合成过程如下：将4-氯苯甲酰氯（1.74 g，0.01 mol）逐滴加入2-氰乙酰肼（0.994 g，0.01 mol）的DMF溶液中，同时搅拌。反应混合物在室温下搅拌3小时后倒入冰水混合物中，沉淀物经过滤、干燥并结晶后得到4-氯-N′-(2-氰乙酰)苯肼（1）。

该化合物为黄色粉末，熔点为200°C；红外光谱（KBr，cm⁻¹）显示特征吸收峰：3197、3068（2 NH）、2210（CN）、1697、1655。

作者贡献声明

Seham Sabry Abd Elmeneim Deghaidi：负责写作、审稿与编辑、数据可视化、项目管理、方法学研究、数据分析及概念构思。 Esraa Nazieh El-Bery：负责写作、审稿与编辑、数据可视化、项目监督、方法学研究、数据管理及概念构思。 Sabreen Mohamed El-Gamasy：负责写作、审稿与编辑、数据可视化、项目监督及方法学研究。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。