铜是所有生物体必需的微量元素[1]。然而，由于铜的毒性，细胞内自由铜的浓度受到严格控制。革兰氏阴性细菌拥有多种铜转运系统，以满足细胞的铜需求，同时降低其毒性[2]、[3]、[4]。在细胞内实现铜在蛋白质之间转移的关键因素是铜从初始结合伴侣到后续结合伴侣的亲和力增加[5]。细胞内的最终铜受体是铜酶，这些酶的催化作用严重依赖于铜。铜酶包括细胞色素c氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、多铜氧化酶、亚硝酸盐和一氧化二氮还原酶等[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。
硫氰酸脱氢酶（TcDH，EC 1.8.2.7）是一种铜酶，能够催化硫氰酸氧化为氰酸盐和单质硫[11]、[12]。TcDH在溶液中以同源二聚体的形式存在（图1A）[11]。TcDH的独特活性位点由三个铜离子组成的簇构成，位于单体折叠成7叶片β螺旋结构中心处的底部分裂处[11]、[12]。来自硫氧化细菌Thioalkalivibrio paradoxus（tpTcDH）和Pelomicrobium methylotrophicum（pmTcDH）的两种同源TcDH及其与抑制剂和底物类似物的X射线结构已获知（氨基酸序列同源性为69%）[11]、[12]。这两种酶在结构和物理化学性质上非常相似，其三铜簇（Cu1、Cu2和Cu3离子）的排列也几乎相同（图1B、C），其配位环境的均方根偏差为0.65 Å（使用所有Cα原子计算）[12]。原子分辨率的提高使我们能够详细了解TcDH的活性位点结构、其在催化循环中发生的构象变化、组成铜离子的配位环境以及酶分子机制的细节[12]。
在分离过程中，野生型TcDH会失去铜离子，需要激活才能恢复催化活性。如先前研究所示，无论是野生型酶还是重组酶的激活（即恢复酶活性）都可以通过Cu(II)或Cu(I)离子来实现，但所需时间尺度不同[11]、[13]。
对于其他含铜酶，也观察到了不同铜氧化态对激活效率的影响。例如，对于来自Bacillus subtilis的apo-CotA漆酶，用Cu(II)离子处理会导致铜位点填充不完全（每个蛋白质分子2.5±0.3个铜离子），而用Cu(I)处理则会导致所有位点完全填充（每个蛋白质分子4.2±0.7个铜离子）[14]。有研究表明Cu(I)负责体内CotA中心的组装。对于另一种多铜氧化酶Fet3p（来自酵母，可催化Fe(II)的氧化）也得出了类似结论[15]。在Coriolopsis caperata的漆酶中，当T2中心缺失时，只有用Cu(I)处理才能恢复活性[16]。此外，还原剂NH2OH的添加促进了Streptomyces castaneoglobisporus的酪氨酸酶的铜离子结合过程，即Cu(I)离子的结合速度比Cu(II)离子快[17]。细胞色素c氧化酶、N2O还原酶以及甲烷氧化菌和氨氧化菌中的独特PmoD和AmoD/AmoE蛋白中的双核混合价CuA中心可以通过添加Cu(II)和Cu(I)在体外组装[18]。CuA簇的Cu(II)离子填充是通过Cu(II)先还原为Cu(I)并在中心半胱氨酸之间形成二硫键来实现的[20]。后来提出了细胞色素c氧化酶CuA中心的体内组装机制，其中金属伴侣ScoI和PcuC分别提供等量的Cu(II)和Cu(I)[21]。N2O还原酶中CuA和CuZ中心的体内组装则由金属伴侣NosL和转运蛋白NosDFY促进，它们能够结合并转移Cu(I)[10]、[22]。从文献可以看出，了解体外铜离子结合到酶活性中心的过程不仅对进一步表征酶本身至关重要，也对建立体内组装机制具有重要意义。
在本研究中，我们探讨了体外铜离子结合到TcDH活性位点以及三铜簇形成的过程。我们首次估算了TcDH的激活/失活速率，这些速率与铜离子结合/从活性位点去除的过程相关。通过使用竞争性配体（结合Cu(II)/Cu(I)）进行滴定，首次获得了TcDH活性中心三个铜结合位点的亲和力。通过EPR技术阐明了铜离子进入酶活性位点铜结合位点的顺序，该技术广泛应用于含铜酶的研究，有助于了解其金属中心的结构、反应机制和电子转移途径[23]、[24]、[25]。本研究提供了TcDH活性位点铜离子结合的热力学和动力学评估，从而为理解体内铜离子结合机制奠定了基础。
